Pour commencer, obtenez des cellules THP-1 différenciées et retirez le milieu épuisé des puits de la plaque de culture Après avoir lavé les cellules avec du PBS, ajoutez un milieu sans sérum contenant du lipopolysaccharide, ou LPS, aux cellules et incubez la plaque. Ajoutez ensuite la solution mère d’adénosine triphosphate ou d’ATP au groupe modèle et incubez la plaque pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, aspirez tout le surnageant des puits de la plaque de culture.
Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, ajoutez 500 microlitres de 0,05% de trypsine sans EDTA dans chaque puits et incubez pendant 30 secondes. Pour arrêter le détachement des cellules, ajoutez un millilitre de milieu RPMI 1640 et transférez les cellules dans un tube de cinq millilitres. Centrifugez le tube à 300 G pendant trois minutes à température ambiante.
Après avoir remis les cellules en suspension dans un millilitre de PBS, placez le tube avec les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois minutes et centrifugez. Pour remettre les cellules en suspension, ajoutez 100 microlitres de tampon de liaison 1X et transférez les cellules dans un nouveau tube de cinq millilitres. Incuber les tubes de contrôle et les tubes modèles avec les réactifs appropriés dans l’obscurité et à température ambiante.
Pour terminer l’incubation, ajoutez 400 microlitres de PBS dans le tube et tourbillonnez-le doucement. Filtrez la suspension cellulaire dans un treillis en nylon de 35 micromètres fixé à un tube en polystyrène à fond rond de cinq millilitres. Trempez un verre de couverture propre dans une solution d’alun de chrome pendant deux heures et séchez-le dans un four à 37 degrés Celsius.
Granulez les cellules trypsinisées comme démontré précédemment, et fixez les cellules avec 500 microlitres de fixateur de microscope électronique pendant deux heures à température ambiante, suivies d’une nuit d’incubation à quatre degrés Celsius. Après avoir recueilli les cellules de la solution fixée, granulez-les à 300 G pendant trois minutes à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres de PBS et soufflez doucement les cellules.
Déposez la suspension cellulaire sur un verre de protection et laissez-la reposer pendant cinq minutes. Aspirez tout le surnageant et lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Ajouter 500 microlitres de solution de fixation d’acide osmique à 1%.
Au bout d’une heure, aspirez tout le surnageant. Après trois lavages PBS, déshydratez les échantillons à des concentrations croissantes d’éthanol. Allumez le sécheur à point critique, ouvrez le réservoir de dioxyde de carbone et refroidissez la chambre à 10 degrés Celsius.
Enveloppez rapidement l’échantillon avec du papier filtre et placez-le dans la chambre lorsque la pression de la chambre est de zéro livre par pouce carré. Une fois que la température se stabilise à 35 degrés Celsius et que la pression atteint 1 250 livres par pouce carré, dépressurisez à 100 livres par pouce carré par minute. Retirer l’échantillon lorsque la pression de la chambre est nulle.
Enfin, à l’aide d’un ruban conducteur, montez les échantillons sur un microscope électronique à balayage, des supports d’échantillons en aluminium utilisant un codeur de pulvérisation cathodique. Couvrez les échantillons d’une couche d’or de deux à cinq nanomètres. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’après la stimulation LPS/ATP, les cellules de la région QT ont augmenté de manière significative, indiquant la mort cellulaire.
Les micrographies électroniques à balayage de la surface de la membrane plasmique ont montré des caractéristiques de pyroptose, notamment des bulles membranaires et une rupture dans les cellules stimulées par LPS/ATP, tandis que les cellules témoins semblaient normales. De plus, la stimulation LPS/ATP a conduit à l’apparition de caractéristiques apoptotiques dans les cellules telles que la bulle membranaire et le rétrécissement cellulaire, et des cellules présentant des caractéristiques de nécroptose, notamment un gonflement cellulaire et une rupture de la membrane, ont été observées.
