Для начала нанесите пипеткой один-два миллилитра раствора для полоскания, препятствующего прилипанию, в 15-миллилитровую коническую трубку. Покрутите трубку, чтобы покрыть ее поверхность. Затем пипеткой нанесите пять миллилитров раствора DPBS в пробирку после удаления раствора, препятствующего прилипанию.
Закройте пробирки с покрытием до тех пор, пока это не понадобится. Выведите пипеткой любую среду в планшете, содержащем органоидные купола кишечника человека. С помощью пипетки объемом в один миллилитр добавьте один миллилитр холодной среды DMEM/F-12 непосредственно в купол, чтобы отсоединить его от пластины.
Нанесите пипеткой еще один миллилитр среды, чтобы собрать оставшиеся органоиды. Переложите суспензию в покрытые 15-миллилитровыми коническими трубками. Пипеткой нагнетайте суспензию вверх и вниз, чтобы разрушить органоиды до тех пор, пока не будет создана однородная фрагментная суспензия с желаемым размером органоидов.
Далее пипеткой выведите аликвоту из суспензии для подсчета. Оставшуюся суспензию положите на лед. Нарисуйте сетку XY на дне каждой лунки 96-луночного планшета с плоским дном.
Пипеткой внесите 50 микролитров DPBS в лунки. Перелейте по пять микролитров аликвоты в каждую лунку. Вручную подсчитайте общее количество органоидов диаметром от 50 до 200 микрометров.
Затем с помощью приведенного уравнения рассчитать объем органоидной суспензии. После подсчета органоидов удалите надосадочную жидкость и мутный слой из пробирки, содержащей оставшуюся комковатую суспензию. Затем пипеткой нанесите два миллилитра холодного DMEM/F-12 прямо на гранулу.
Центрифугируйте суспензию при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Для системы животного происхождения добавьте 40 микролитров холодной одной матричной органоидной гранулы животного происхождения. Пипетируйте органоиды вверх и вниз, чтобы распределить их по матрице.
Аккуратно перенесите смесь органоидов матрицы в центр стерильной, предварительно подогретой 24-луночной тканевой культуральной пластины. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы обеспечить гелеобразование купола. Далее пипеткой внесите 0,5 миллилитра теплой кишечной органоидной питательной среды к стенкам лунки, не нарушая купол перед инкубацией.
Для матрицы из четырех бесксеносных органоидов добавьте 50 микролитров 3Х органоидной питательной среды в сфероидную гранулу. Затем пипеткой пипеткой 100 микролитров выбранной матрицы из четырех бессодержательных органоидов в суспензию. Добавьте 40 микролитров гидрогелевой органоидной смеси в центр 24-луночного планшета для культивирования тканей.
Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации пипеткой по 0,5 миллилитра органоидной питательной среды вдоль стенок лунки. Затем снова инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия при добавлении углекислого газа 5% и влажности 95%.