preparation and collection of drosophila embryos for transgenesis

phiC31 טרנסגנזה של עובר בתיווך אינטגראז בדרוזופילה

The fruit fly Drosophila melanogaster is extremely amenable to genetic manipulation and genetic analysis. Transgenic fruit flies are widely used in biological research. Since it was developed in the early 1980s, P-element transposon-mediated transgenesis has been indispensable for Drosophila research1. In some scenarios, other transposons, such as piggyBac and Minos have been used for transgenesis in Drosophila as well2. Transgenes via transposon are randomly inserted into the Drosophila genome, and the expression levels of transgenes at different genomic loci may vary due to position effects and thereby can not be compared2. These drawbacks were overcome by the phiC31-mediated site-specific transgenesis3. The bacteriophage&#160;phiC31 gene encodes an integrase that mediates sequence-specific recombination between the attB and attP sites in Drosophila3. Many attP docking sites have been characterized and are available in the Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
The phiC31 transgenesis system for Drosophila has been widely used by the fly community. Among the attP docking sites, attP18 on the X chromosome, attP40 on the second chromosome, and attP2 on the third chromosome are usually the preferred sites for transgene integration on each chromosome because transgenes at the three sites show high levels of inducible expression while having low levels of basal expression5. Recently, however, van der Graaf and colleagues found that the attP40 site, close to the Msp300 gene locus, and transgenes integrated at attP40 cause larval muscle nuclear clustering in Drosophila10. In another recent study, Duan and colleagues found that the homozygous attP40 chromosome disrupts the normal glomerular organization of the Or47b olfactory receptor neuron class in Drosophila11. These findings suggest that rigorous controls should be included when designing experiments and interpreting data.
Drosophila is an ideal model organism for in vivo interrogation of gene function due to its short life cycle, low cost, and easy maintenance. Genome-wide genetic screening relies on the construction of genome-wide transgenic libraries in Drosophila12,13,14,15. We previously generated 5551 UAS-cDNA/ORF constructs based on the binary GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS) system, covering 83% of the Drosophila genes conserved in humans in the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. The UAS-cDNA/ORF plasmids can be used for the creation of a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Efficient embryo microinjection technology can accelerate the creation of transgenic fly libraries.
For embryo microinjection, the needle tip is normally broken against a coverslip17. Thereby, needles frequently become clogged or cause leakage of large amounts of cytoplasm, and when these issues arise, new needles must be employed. Although beveling needles can enhance microinjection efficiency, the grinding solution enters the beveled tip during the grinding process. The grinding solution in the beveled tip does not quickly evaporate naturally; therefore, needles can not be utilized for microinjection directly after beveling. These factors reduce the efficiency of embryo microinjection procedures. Here, using the phiC31-mediated site-specific transgenesis in Drosophila as an example, we present a protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.&#160;To prevent the grinding solution from entering the needle, we utilize an air pump to exert air pressure within the needle, thereby preventing the grinding solution from entering the beveled tip. Beveled needles are ready for sample loading and microinjection directly after beveling.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של מיקרו-הזרקה לעובר עבור טרנסגנזה בדרוזופילה

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

Transgenesis in Drosophila is essential for studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for construction of transgenic flies. Here, we take the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and present a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.Injection needles whose tips are beveled by a grinder do not usually get blocked or elicit large cytoplasmic leakage. However, the grinding solution can enter the beveled tip of a needle during the grinding process and the grinding solution inside the tip does not naturally dry up quickly. Our protocol uses a foot air pump with a pressure gauge to apply air pressure to a needle while grinding its tip.This prevents the grinding solution from siphoning, thereby the grinding solution is prevented from entering the beveled tip, enabling the beveled needle to be used immediately.

הכנה ואיסוף של עוברי דרוזופילה לטרנסגנזה

כדי להתחיל, להרטיב מטלית עם תמיסת שחיקה. תקן את המטלית על מטחנת המחטים, ולאחר מכן חבר מחט למשאבת אוויר ברגל באמצעות צינור סיליקון נימי. הרכיבו את המחט על מחזיק המחט של המטחנה.התאימו את זווית המחט כך שהיא תהיה כפופה 35 מעלות לצלחת השחזה. השתמש בידית הבקרה הגסה מתחת למיקרוסקופ כדי להתאים את מיקום קצה המחט עד שהוא ממוקם ממש מעל משטח השחזה. לאחר מכן, השתמש במשאבת האוויר ברגל כדי לשמור על הלחץ הפנימי של המחט על 40 פאונד לאינץ 'מרובע.לאחר מכן, השתמש בידית הבקרה העדינה כדי לגרום לקצה המחט לגעת בצלחת השחזה. לאחר טחינה של שלוש עד חמש שניות, פרקו את המחט כאשר בועות אוויר מתחילות לצאת מהקצה. לאחר מכן, לחמם פיפטה 200 מיקרוליטר עם הלהבה החיצונית של מבער אלכוהול.כאשר קצה פיפטה מתחיל להמיס, למתוח אותו. חותכים את הקצה האטום של קצה פיפטה עם מספריים. כדי dechlorinate עוברי drosophila, להסיר את הזבובים מן צלחות אגר מיץ ענבים עם מברשת.שטפו את העוברים שנאספו במסננת תאים במים מזוקקים כפול. יבש את מסננת התא עם נייר טישו. לאחר מכן, מניחים את המסננת המיובשת בצלחת פטרי המכילה 30% אקונומיקה.ערבבו ידנית את מסננת התאים כדי להבטיח ערבוב אחיד. שטפו את העוברים במים מזוקקים פעמיים במשך שתי דקות לפני שאתם בוחרים את העוברים הצפים בעזרת מברשת צבע כדי ליצור מערך לטרנסגנזה נוספת.

Research

JoVE Journal

Genetics

Preparation and Collection of Drosophila Embryos for Transgenesis

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Microinjection of Drosophila Embryos for phiC31 Integrase Mediated Embryo Transgenesis

מיקרו-הזרקה של עוברי דרוזופילה עבור phiC31 Integrase Mediated Embryo Transgenesis