まず、製造元の指示に従って、O2K呼吸計に0.5ミリリットルのチャンバーを取り付けます。機器の電源を入れ、付属のソフトウェアに接続してデータを取得します。脱イオン水でチャンバーを3回洗浄します。
水を0.54ミリリットルのMiR05と交換し、ストッパーを完全に閉じます。余分なバッファーを取り除いた後、ストッパーを上げて、室内の酸素がチャンバー酸素と平衡化します。磁気セルセパレーターの磁場にカラムを置き、3ミリリットルのRP5でカラムを洗浄します。
新たに分離された末梢血単核細胞(PBMCペレット)を、80マイクロリットルのRP5と20マイクロリットルの抗CD14マイクロビーズに再懸濁します。細胞を摂氏4度で15分間インキュベートします。懸濁液をカラムにロードする前に、細胞を1ミリリットルのRP5で希釈します。
Flow Through Oneとラベル付けされた15ミリリットルの円錐管に流れる標識のない細胞を収集します」3ミリリットルのRP5でカラムを3回洗浄して、液体を流れる流れを収集します。カラムを磁場から慎重に取り外し、新しい15ミリリットルの円錐管に置きます。5ミリリットルのRP5を追加した後、プランジャーをカラムに押し込み、内容物をチューブに集めます。
1本のチューブで流れを遠心分離した後、細胞と抗CD3マイクロビーズを使用して単離ステップを繰り返し、Tリンパ球を取得します。CD3陽性T細胞およびCD14陽性単球を含む細胞を遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルのRP5に再懸濁します。
血球計算盤を使用して、細胞濃度を決定します。250万個の単球と500万個のT細胞を新しい遠心分離チューブに加えます。細胞をペレット化し、20 マイクロリットルの MiR05 に再懸濁します。
蛍光センサーを取り付け、O2K呼吸計ユニットで実験ファイルを開始します。緑色LED蛍光センサーを使用し、AMRフィルターをセットして、蛍光光度計のゲインと強度を1000に調整します。チャンバー容量を0.5ミリリットルに設定し、酸素フラックスとTMRM蛍光の両方が表示されるようにレイアウトを調整します。
酸素フラックスが安定したら、メーカーのプロトコルに従って空気酸素校正を実行します。ストッパーを閉じてチャンバーを密閉します。ハミルトンシリンジを使用して、2.5マイクロリットルの0.05ミリモルテトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)を4回注入します。.
TMRM の 0、0.25、0.5、0.75、および 1.0 マイクロモルを表す各注入の蛍光シグナルを使用して、フローセンサーをキャリブレーションします。20 マイクロリットルの MiR05 を注入して、ブランク実験を実行します。酸素フラックスが安定したら、酸素フラックスとTMRMシグナルの両方をプレセルとして選択し、標識します。
細胞を含む細胞懸濁液を20マイクロリットル注入し、約10分間測定します。次に、酸素フラックス信号とTMRM信号の両方を細胞として選択し、標識します。次に、各処理の手順を順番に繰り返し、酸素フラックスとTMRM信号を適切にラベル付けします。
酸素フラックスが安定したら、1マイクロリットルの1.25ミリモルアンチマイシンAを注入して、ミトコンドリア呼吸を阻害します。ブランク実験ごとに、サンプル前のTMRM濃度を1に設定して、バックグラウンド比を計算します。その後のTMRMの比例減少と、すべてのブランク実験からの平均バックグラウンド比を計算します。
次に、サンプル実験のプレサンプルTMRMに、各サンプル実験の各注入の平均バックグラウンド比を掛けます。サンプルの測定されたTMRM値に実験の背景を差し引きます。次に、各注入からFCCPバックグラウンド補正ミトコンドリア膜電位を差し引きます。
ADP による減少を正規化するには、膜電位の上限と最低をそれぞれ 100% と 0% に設定し、データを非線形近似回帰モデルに当てはめます。健康なボランティアのT細胞と単球のADPによる変化の比較研究では、単球はT細胞と比較してミトコンドリア膜電位の喪失が大きいことが示されました。ミトコンドリア膜電位上のADPの半値最大阻害濃度は、T細胞と比較して単球の方が低かった。
ADPによる酸素消費率の典型的な用量反応の増加は、どちらの細胞タイプでも検出されませんでした。