للبدء ، قم بتثبيت غرف 0.5 ملليلتر في مقياس التنفس O2K وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتشغيل الأداة وتوصيلها بالبرنامج المقدم للحصول على البيانات. اغسل الغرف ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات.
استبدل الماء ب 0.54 ملليلتر من MiR05 وأغلق السدادات بالكامل. بعد إزالة المخزن المؤقت الزائد ، ارفع السدادات للسماح لأكسجين الغرفة بالتوازن مع أكسجين الغرفة. ضع عمودا في المجال المغناطيسي لفاصل الخلايا المغناطيسية واغسل العمود بثلاثة ملليلتر من RP5.
أعد تعليق خلية الدم أحادية النواة المعزولة حديثا ، أو حبيبات PBMC ، في 80 ميكرولترا من RP5 ، إلى جانب 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة ل CD14. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تمييع الخلايا مع ملليلتر واحد من RP5 قبل تحميل التعليق على العمود.
اجمع الخلايا غير المصنفة التي تتدفق عبر أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يسمى التدفق عبر واحد"اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من RP5 لجمع التدفق عبر السائل. قم بإزالة العمود بعناية من المجال المغناطيسي وضعه على أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر. بعد إضافة خمسة ملليلتر من RP5 ، ادفع المكبس في العمود لجمع المحتويات في الأنبوب.
بعد الطرد المركزي للتدفق عبر أنبوب واحد ، كرر خطوات العزل باستخدام الميكروبيدات المضادة ل CD3 مع الخلايا للحصول على الخلايا الليمفاوية التائية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تحتوي على الخلايا التائية الإيجابية CD3 والخلايا الوحيدة الإيجابية CD14. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من RP5.
باستخدام مقياس الدم ، حدد تركيز الخلية. أضف 2.5 مليون خلية وحيدة و 5 ملايين خلية تائية في أنابيب طرد مركزي جديدة. بيليه الخلايا وإعادة تعليقها في 20 ميكرولتر من MiR05.
قم بتثبيت مستشعرات الفلورسنت وابدأ ملفا تجريبيا على وحدة مقياس التنفس O2K. باستخدام مستشعرات الفلورسنت LED الخضراء ، مع مجموعة مرشح AMR ، اضبط كسب مقياس الفلور والشدة إلى 1000. اضبط حجم الغرفة على 0.5 ملليلتر واضبط التخطيط لرؤية كل من تدفق الأكسجين ومضان TMRM.
بمجرد استقرار تدفق الأكسجين ، قم بإجراء معايرة الأكسجين في الهواء وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أغلق السدادات لإغلاق الغرفة. باستخدام حقنة هاملتون ، قم بحقن 2.5 ميكرولتر من 0.05 مليمولار رباعي ميثيل رودامين ميثيل استر ، أو TMRM ، أربع مرات.
قم بمعايرة مستشعر التدفق بإشارة فلورسنت لكل حقنة تمثل 0 و 0.25 و 0.5 و 0.75 و 1.0 ميكرومولار من TMRM. حقن 20 ميكرولتر من MiR05 لتشغيل التجربة الفارغة. بعد استقرار تدفق الأكسجين ، حدد وتسمية كل من تدفق الأكسجين وإشارة TMRM كخلية مسبقة.
حقن 20 ميكرولتر من معلق الخلية التي تحتوي على الخلايا وقياس لمدة 10 دقائق. ثم حدد وقم بتسمية كل من إشارات تدفق الأكسجين و TMRM كخلايا. ثم كرر الخطوات لكل علاج بالتتابع وقم بتسمية تدفق الأكسجين وإشارة TMRM بشكل مناسب.
بمجرد استقرار تدفق الأكسجين ، احقن ميكرولترا واحدا من 1.25 مليمول مضاد الميسين A لتثبيط تنفس الميتوكوندريا. لكل تجربة فارغة ، اضبط تركيز TMRM قبل العينة على واحد لحساب نسبة الخلفية. احسب الانخفاض النسبي اللاحق في TMRM ومتوسط نسبة الخلفية من جميع التجارب الفارغة.
ثم اضرب TMRM قبل العينة لتجربة العينة بمتوسط نسبة الخلفية لكل حقنة لكل تجربة عينة. اطرح خلفية التجربة إلى قيم TMRM المقاسة للعينة. بعد ذلك ، اطرح خلفية FCCP المصححة لغشاء الميتوكوندريا من كل حقنة.
لتطبيع الانخفاض المدفوع ب ADP ، قم بتعيين أعلى وأدنى جهد غشاء على أنه 100٪ و 0٪ على التوالي ، وقم بملاءمة البيانات في نموذج انحدار ملاءمة غير خطي. أظهرت الدراسات المقارنة حول التغيرات المدفوعة ب ADP في الخلايا التائية والوحيدات من المتطوعين الأصحاء أن الخلايا الوحيدة أظهرت خسارة أكبر في إمكانات غشاء الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التائية. كان التركيز المثبط نصف الأقصى ل ADP على جهد غشاء الميتوكوندريا أقل بالنسبة للوحيدات مقارنة بالخلايا التائية.
لم يتم الكشف عن زيادة استجابة الجرعة النموذجية في معدلات استهلاك الأكسجين مع ADP في أي من نوعي الخلايا.
