For at begynde skal du installere 0,5 ml kamre i O2K-respirometeret i henhold til producentens anvisninger. Tænd for instrumentet, og tilslut det til den medfølgende software til dataindsamling. Vask kamrene tre gange med deioniseret vand.
Udskift vandet med 0.54 ml MiR05 og luk propperne helt. Når den overskydende buffer er fjernet, hæves propperne, så rumilt kan komme i ligevægt med kammerilt. Placer en søjle i magnetfeltet på en magnetisk celleseparator, og vask søjlen med tre milliliter RP5.
Gensuspender den nyligt isolerede mononukleære celle i perifert blod, eller PBMC-pellet, i 80 mikroliter RP5 sammen med 20 mikroliter anti-CD14-mikroperler. Inkuber cellerne i 15 minutter ved fire grader Celsius. Fortynd cellerne med en milliliter RP5, før suspensionen lægges på søjlen.
Saml umærkede celler, der strømmer igennem i et 15 milliliter konisk rør mærket som flow gennem en"Vask søjlen tre gange med tre milliliter RP5 for at opsamle strømmen gennem væske. Fjern forsigtigt søjlen fra magnetfeltet og placer den på et nyt 15 ml konisk rør. Efter tilsætning af fem milliliter RP5 skal du skubbe stemplet ind i søjlen for at samle indholdet i røret.
Efter centrifugering af flowet gennem et rør gentages isolationstrinene ved hjælp af anti-CD3-mikroperler med cellerne for at opnå T-lymfocytter. Centrifuger cellerne indeholdende CD3-positive T-celler og CD14-positive monocytter. Efter at have kasseret supernatanten, suspender pillen igen i en milliliter RP5.
Brug et hæmocytometer til at bestemme cellekoncentrationen. Tilføj 2,5 millioner monocytter og 5 millioner T-celler i nye centrifugerør. Pellet cellerne og opslæm dem igen i 20 mikroliter MiR05.
Installer de fluorescerende sensorer, og start en eksperimentel fil på O2K-respirometerenheden. Brug de grønne LED-fluorescerende sensorer, med AMR-filteret indstillet, til at justere fluorometerforstærkningen og intensiteten til 1000. Indstil kammervolumen til 0.5 milliliter, og juster layoutet for at se både iltflux og TMRM-fluorescens.
Når iltfluxen er stabil, skal du udføre luftiltkalibreringen i henhold til producentens protokol. Luk propperne for at forsegle kammeret. Brug en Hamilton-sprøjte til at injicere 2,5 mikroliter 0,05 millimolar tetramethylrhodamin methylester eller TMRM fire gange.
Kalibrer flowsensoren med et fluorescerende signal for hver injektion, der repræsenterer 0, 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 mikromolar TMRM. Injicer 20 mikroliter MiR05 for at køre det tomme eksperiment. Når iltfluxen er stabiliseret, skal du vælge og mærke både iltfluxen og TMRM-signalet som præ-celle.
Injicer 20 mikroliter af cellesuspensionen, der indeholder cellerne, og mål i ca. 10 minutter. Vælg og mærk derefter både iltfluxen og TMRM-signalerne som celler. Gentag derefter trinene for hver behandling sekventielt og mærk iltfluxen og TMRM-signalet korrekt.
Når iltfluxen er stabil, injiceres en mikroliter 1,25 millimolar antimycin A for at hæmme mitokondrieåndedrættet. For hvert blindeksperiment skal du indstille TMRM-koncentrationen til én for at beregne baggrundsforholdet. Beregn det efterfølgende proportionale fald i TMRM og det gennemsnitlige baggrundsforhold fra alle blanke eksperimenter.
Multiplicer derefter pre-sample TMRM for prøveeksperimentet med det gennemsnitlige baggrundsforhold for hver injektion af hvert prøveeksperiment. Træk eksperimentets baggrund fra de målte TMRM-værdier for prøven. Træk derefter det FCCP-baggrundskorrigerede mitokondriemembranpotentiale fra hver injektion.
For at normalisere det ADP-drevne fald skal du indstille det højeste og laveste membranpotentiale til henholdsvis 100 % og 0 % og tilpasse dataene til en ikke-lineær tilpasningsregressionsmodel. Sammenlignende undersøgelser af ADP-drevne ændringer i T-celler og monocytter fra raske frivillige viste, at monocytter viste større tab af mitokondriemembranpotentiale sammenlignet med T-celler. Den halve maksimale hæmmende koncentration af ADP på mitokondriemembranpotentialet var lavere for monocytter sammenlignet med T-cellerne.
En typisk dosisresponsstigning i iltforbrugshastigheder med ADP blev ikke påvist i nogen af celletyperne.