Installeer om te beginnen kamers van 0.5 milliliter in de O2K-ademhalingsmeter volgens de instructies van de fabrikant. Schakel het instrument in en sluit het aan op de meegeleverde software voor gegevensverzameling. Was de kamers drie keer met gedeïoniseerd water.
Vervang het water door 0,54 milliliter MiR05 en sluit de stoppen volledig. Nadat u de overtollige buffer hebt verwijderd, tilt u de stoppen op zodat de zuurstof in de kamer in evenwicht kan komen met de zuurstof in de kamer. Plaats een kolom in het magnetische veld van een magnetische celscheider en was de kolom met drie milliliter RP5.
Resuspendeer de vers geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcel, of PBMC-pellet, in 80 microliter RP5, samen met 20 microliter anti-CD14-microbeads. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verdun de cellen met één milliliter RP5 voordat u de suspensie op de kolom laadt.
Verzamel niet-gelabelde cellen die doorstromen in een conische buis van 15 milliliter met het label "Was de kolom drie keer met drie milliliter RP5 om de stroom door vloeistof te verzamelen. Haal de kolom voorzichtig uit het magnetische veld en plaats deze op een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Nadat u vijf milliliter RP5 hebt toegevoegd, duwt u de zuiger in de kolom om de inhoud in de buis op te vangen.
Nadat u de stroom door een buis hebt gecentrifugeerd, herhaalt u de isolatiestappen met behulp van anti-CD3-microbeads met de cellen om T-lymfocyten te verkrijgen. Centrifugeer de cellen die CD3-positieve T-cellen en CD14-positieve monocyten bevatten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspendeert u de pellet opnieuw in één milliliter RP5.
Bepaal met behulp van een hemocytometer de celconcentratie. Voeg 2,5 miljoen monocyten en 5 miljoen T-cellen toe aan nieuwe centrifugebuisjes. Pellet de cellen en suspendeer ze opnieuw in 20 microliter MiR05.
Installeer de fluorescentiesensoren en start een experimenteel bestand op de O2K-ademhalingsmetereenheid. Met behulp van de groene LED-fluorescentiesensoren, met de AMR-filterset, stelt u de fluorometerversterking en de intensiteit in op 1000. Stel het kamervolume in op 0.5 milliliter en pas de lay-out aan om zowel de zuurstofflux als de TMRM-fluorescentie te zien.
Zodra de zuurstofflux stabiel is, voert u de luchtzuurstofkalibratie uit volgens het protocol van de fabrikant. Sluit de stoppen om de kamer af te dichten. Injecteer met een Hamilton-spuit vier keer 2,5 microliter 0,05 millimolaire tetramethylrhodaminemethylester of TMRM.
Kalibreer de flowsensor met een fluorescerend signaal voor elke injectie dat 0, 0,25, 0,5, 0,75 en 1,0 micromolair van TMRM vertegenwoordigt. Injecteer 20 microliter MiR05 om het lege experiment uit te voeren. Nadat de zuurstofflux is gestabiliseerd, selecteert en labelt u zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal als pre-cel.
Injecteer 20 microliter van de celsuspensie die de cellen bevat en meet gedurende ongeveer 10 minuten. Selecteer en label vervolgens zowel de zuurstofflux- als de TMRM-signalen als cellen. Herhaal vervolgens de stappen voor elke behandeling achtereenvolgens en label de zuurstofflux en het TMRM-signaal op de juiste manier.
Zodra de zuurstofflux stabiel is, injecteert u één microliter 1,25 millimolair antimycine A om de mitochondriale ademhaling te remmen. Stel voor elk blanco experiment de TMRM-concentratie vóór de steekproef in op één om de achtergrondverhouding te berekenen. Bereken de daaropvolgende proportionele afname in TMRM en de gemiddelde achtergrondverhouding van alle lege experimenten.
Vermenigvuldig vervolgens de TMRM van het monsterexperiment vóór het monster met de gemiddelde achtergrondverhouding voor elke injectie van elk monsterexperiment. Trek de achtergrond van het experiment af van de gemeten TMRM-waarden van het monster. Trek vervolgens de FCCP-achtergrondgecorrigeerde mitochondriale membraanpotentiaal af van elke injectie.
Om de ADP-gestuurde afname te normaliseren, stelt u het hoogste en laagste membraanpotentieel in op respectievelijk 100% en 0% en past u de gegevens in een niet-lineair fit-regressiemodel. Vergelijkende studies naar ADP-gedreven veranderingen in T-cellen en monocyten van gezonde vrijwilligers toonden aan dat monocyten een groter verlies van mitochondriaal membraanpotentieel vertoonden in vergelijking met T-cellen. De half maximale remmende concentratie van ADP op de mitochondriale membraanpotentiaal was lager voor monocyten in vergelijking met de T-cellen.
Een typische dosis-responsverhoging van het zuurstofverbruik met ADP werd in geen van beide celtypen gedetecteerd.
