כדי להתחיל, התקן תאי 0.5 מיליליטר ברספירומטר O2K בהתאם להוראות היצרן. הפעל את המכשיר וחבר אותו לתוכנה שסופקה לרכישת נתונים. לשטוף את החדרים שלוש פעמים עם מים deionized.
החלף את המים עם 0.54 מיליליטר של MiR05 וסגור את הפקקים במלואם. לאחר הסרת החיץ העודף, הרימו את הפקקים כדי לאפשר לחמצן בחדר להתאזן עם חמצן בתא. מקם עמוד בשדה המגנטי של מפריד תאים מגנטי ושטוף את העמוד עם שלושה מיליליטר של RP5.
השהה מחדש את תא הדם החד-גרעיני ההיקפי שזה עתה בודד, או גלולת PBMC, ב -80 מיקרוליטר של RP5, יחד עם 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד CD14. לדגור על התאים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לדלל את התאים עם מיליליטר אחד של RP5 לפני טעינת המתלה על העמודה.
אספו תאים לא מסומנים שזורמים דרך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המסומן כזרימה דרך אחד"שטפו את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של RP5 כדי לאסוף את הזרימה דרך נוזל. הסר בזהירות את העמוד מהשדה המגנטי והנח אותו על צינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר הוספת חמישה מיליליטר של RP5, לדחוף את הבוכנה לתוך העמוד כדי לאסוף תוכן לתוך הצינור.
לאחר צנטריפוגה של הזרימה דרך צינור אחד, חזור על שלבי הבידוד באמצעות מיקרו-כדוריות אנטי CD3 עם התאים כדי לקבל לימפוציטים מסוג T. צנטריפוגה התאים המכילים תאי T חיוביים CD3 ומונוציטים חיוביים CD14. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של RP5.
באמצעות המוציטומטר, לקבוע את ריכוז התא. הוסף 2.5 מיליון מונוציטים ו-5 מיליון תאי T לצינורות צנטריפוגות חדשים. גלולה את התאים ולהשעות אותם מחדש ב 20 מיקרוליטר של MiR05.
התקן את חיישני הפלואורסצנט והתחל קובץ ניסיוני ביחידת הספירומטר O2K. באמצעות חיישני פלורסנט LED ירוקים, עם מסנן AMR, להתאים את רווח פלואורומטר ואת העוצמה ל 1000. הגדר את נפח התא ל- 0.5 מיליליטר וכוונן את הפריסה כדי לראות הן שטף חמצן והן פלואורסצנטיות TMRM.
לאחר ששטף החמצן יציב, בצע את כיול החמצן באוויר בהתאם לפרוטוקול היצרן. סגור את הפקקים כדי לאטום את החדר. באמצעות מזרק המילטון, להזריק 2.5 מיקרוליטר של 0.05 מילימולר tetramethylrhodamine מתיל אסטר, או TMRM, ארבע פעמים.
כייל את חיישן הזרימה עם אות פלואורסצנטי עבור כל הזרקה המייצג 0, 0.25, 0.5, 0.75 ו- 1.0 מיקרומולר של TMRM. הזריקו 20 מיקרוליטר של MiR05 כדי להריץ את הניסוי הריק. לאחר ששטף החמצן מתייצב, בחר ותייג הן את שטף החמצן והן את אות TMRM כקדם-תא.
מזריקים 20 מיקרוליטר של תרחיף התא המכיל את התאים ומודדים במשך כ-10 דקות. לאחר מכן בחר ותייג הן את שטף החמצן והן את אותות TMRM כתאים. לאחר מכן חזור על השלבים עבור כל טיפול ברצף ותייג את שטף החמצן ואת אות TMRM בהתאם.
ברגע ששטף החמצן יציב, הזריקו מיקרוליטר אחד של אנטימיצין A של 1.25 מילימולר כדי לעכב נשימה מיטוכונדריאלית. עבור כל ניסוי ריק, הגדר את ריכוז TMRM לפני הדגימה לאחד כדי לחשב את יחס הרקע. חשב את הירידה היחסית שלאחר מכן ב- TMRM ואת יחס הרקע הממוצע מכל הניסויים הריקים.
לאחר מכן הכפילו את ה-TMRM שלפני הדגימה של ניסוי הדגימה ביחס הרקע הממוצע עבור כל זריקה של כל ניסוי דגימה. הפחת את רקע הניסוי לערכי TMRM הנמדדים של הדגימה. לאחר מכן, הפחת את פוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי המתוקן ברקע FCCP מכל הזרקה.
כדי לנרמל את הירידה המונעת על-ידי ADP, הגדר את פוטנציאל הממברנה הגבוה ביותר והנמוך ביותר כ- 100% ו- 0% בהתאמה, והכנס את הנתונים למודל רגרסיה של התאמה לא ליניארית. מחקרים השוואתיים על שינויים מונעי ADP בתאי T ומונוציטים ממתנדבים בריאים הראו כי מונוציטים הראו אובדן גדול יותר של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בהשוואה לתאי T. הריכוז המעכב החצי מקסימלי של ADP על פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית היה נמוך יותר עבור מונוציטים בהשוואה לתאי T.
עלייה אופיינית בתגובת מינון בקצב צריכת החמצן עם ADP לא זוהתה באף אחד מסוגי התא.