शुरू करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार O2K रेस्पिरोमीटर में 0.5 मिलीलीटर कक्ष स्थापित करें। उपकरण चालू करें और इसे डेटा अधिग्रहण के लिए प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर से कनेक्ट करें। कक्षों को विआयनीकृत पानी से तीन बार धोएं।
पानी को 0.54 मिलीलीटर MiR05 से बदलें और स्टॉपर्स को पूरी तरह से बंद कर दें। अतिरिक्त बफर को हटाने के बाद, कमरे ऑक्सीजन कक्ष ऑक्सीजन के साथ संतुलन करने के लिए अनुमति देने के लिए stoppers उठा. एक चुंबकीय सेल विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एक स्तंभ रखें और RP5 के तीन मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें.
आरपी 5 के 80 माइक्रोलीटर में ताजा पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल, या पीबीएमसी गोली को फिर से निलंबित करें, साथ ही एंटी सीडी 14 माइक्रोबीड्स के 20 माइक्रोलीटर के साथ। चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं. स्तंभ पर निलंबन लोड करने से पहले RP5 के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं पतला.
एक के माध्यम से प्रवाह के रूप में लेबल एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से प्रवाह कि unlabeled कोशिकाओं लीजिए तरल के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा करने के लिए RP5 के तीन मिलीलीटर के साथ स्तंभ तीन बार धो लें. ध्यान से चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ को हटा दें और इसे एक नए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर रखें। RP5 के पांच मिलीलीटर जोड़ने के बाद, ट्यूब में सामग्री एकत्र करने के लिए स्तंभ में सवार धक्का.
एक ट्यूब के माध्यम से प्रवाह को अपकेंद्रित्र करने के बाद, टी लिम्फोसाइटों को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के साथ एंटी सीडी 3 माइक्रोबीड्स का उपयोग करके अलगाव चरणों को दोहराएं। सीडी 3 पॉजिटिव टी-कोशिकाओं और सीडी 14 सकारात्मक मोनोसाइट्स युक्त कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागने के बाद, आरपी 5 के एक मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित.
हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, सेल एकाग्रता निर्धारित करें। नए अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 2.5 मिलियन मोनोसाइट्स और 5 मिलियन टी-कोशिकाओं को जोड़ें। कोशिकाओं को गोली और उन्हें MiR05 के 20 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित करें।
फ्लोरोसेंट सेंसर स्थापित करें और O2K रेस्पिरोमीटर इकाई पर एक प्रयोगात्मक फ़ाइल शुरू करें। हरे एलईडी फ्लोरोसेंट सेंसर का उपयोग करके, एएमआर फिल्टर सेट के साथ, फ्लोरोमीटर लाभ और तीव्रता को 1000 तक समायोजित करें। चैम्बर वॉल्यूम को 0.5 मिलीलीटर पर सेट करें और ऑक्सीजन फ्लक्स और टीएमआरएम प्रतिदीप्ति दोनों को देखने के लिए लेआउट को समायोजित करें।
एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार वायु ऑक्सीजन अंशांकन करें। कक्ष को सील करने के लिए स्टॉपर्स बंद करें। हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके, 0.05 मिलीमोलर टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर, या टीएमआरएम के 2.5 माइक्रोलीटर को चार बार इंजेक्ट करें।
टीएमआरएम के 0, 0.25, 0.5, 0.75 और 1.0 माइक्रोमोलर का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रत्येक इंजेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ फ्लो सेंसर को कैलिब्रेट करें। रिक्त प्रयोग को चलाने के लिए MiR05 के 20 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, ऑक्सीजन प्रवाह और टीएमआरएम सिग्नल दोनों को प्री-सेल के रूप में चुनें और लेबल करें।
कोशिकाओं युक्त सेल निलंबन के 20 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें और लगभग 10 मिनट के लिए मापें। फिर कोशिकाओं के रूप में ऑक्सीजन प्रवाह और टीएमआरएम संकेतों दोनों का चयन करें और लेबल करें। फिर क्रमिक रूप से प्रत्येक उपचार के लिए चरणों को दोहराएं और ऑक्सीजन प्रवाह और टीएमआरएम सिग्नल को उचित रूप से लेबल करें।
एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बाधित करने के लिए 1.25 मिलीमीटर एंटीमाइसिन ए के एक माइक्रोलीटर को इंजेक्ट करें। प्रत्येक रिक्त प्रयोग के लिए, पृष्ठभूमि अनुपात की गणना करने के लिए एक करने के लिए पूर्व नमूना टीएमआरएम एकाग्रता सेट. टीएमआरएम में बाद के आनुपातिक कमी और सभी रिक्त प्रयोगों से औसत पृष्ठभूमि अनुपात की गणना करें।
फिर प्रत्येक नमूना प्रयोग के प्रत्येक इंजेक्शन के लिए औसत पृष्ठभूमि अनुपात के साथ नमूना प्रयोग के पूर्व नमूना टीएमआरएम गुणा करें। नमूने के मापा टीएमआरएम मूल्यों के लिए प्रयोग की पृष्ठभूमि घटाना. अगला, FCCP पृष्ठभूमि प्रत्येक इंजेक्शन से mitochondrial झिल्ली क्षमता सही घटाना.
एडीपी संचालित कमी को सामान्य करने के लिए, क्रमशः 100% और 0% के रूप में उच्चतम और निम्नतम झिल्ली क्षमता सेट करें, और डेटा को गैर-रैखिक फिट प्रतिगमन मॉडल में फिट करें। स्वस्थ स्वयंसेवकों से टी-कोशिकाओं और मोनोसाइट्स में एडीपी संचालित परिवर्तनों पर तुलनात्मक अध्ययन से पता चला है कि मोनोसाइट्स ने टी-कोशिकाओं की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का अधिक नुकसान प्रदर्शित किया। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर एडीपी की आधी अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता टी कोशिकाओं की तुलना में मोनोसाइट्स के लिए कम थी।
एडीपी के साथ ऑक्सीजन की खपत दर में एक विशिष्ट खुराक प्रतिक्रिया वृद्धि किसी भी सेल प्रकार में नहीं पाई गई थी।