시작하려면 제조업체의 지침에 따라 O2K 호흡계에 0.5밀리리터 챔버를 설치하십시오. 기기를 켜고 데이터 수집을 위해 제공된 소프트웨어에 연결합니다. 탈이온수로 챔버를 세 번 세척합니다.
물을 0.54ml의 MiR05로 교체하고 스토퍼를 완전히 닫습니다. 과도한 완충액을 제거한 후 스토퍼를 들어 올려 실내 산소가 챔버 산소와 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 자기 셀 분리기의 자기장에 컬럼을 놓고 RP5 3밀리리터로 컬럼을 세척합니다.
갓 분리한 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC 펠릿을 80마이크로리터의 RP5와 20마이크로리터의 항 CD14 마이크로비즈에 다시 현탁시킵니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 현탁액을 컬럼에 로드하기 전에 세포를 RP5 1m리터로 희석합니다.
15 밀리리터의 원뿔형 튜브로 흘러 들어가는 라벨링되지 않은 세포를 수집합니다. "3 밀리리터의 RP5로 컬럼을 세 번 세척하여 액체를 통한 흐름을 수집합니다. 자기장에서 컬럼을 조심스럽게 제거하고 새 15밀리리터 원추형 튜브에 놓습니다. RP5 5ml를 넣은 후 플런저를 컬럼에 밀어 넣어 내용물을 튜브에 모읍니다.
하나의 튜브를 통해 흐름을 원심분리한 후 세포와 함께 항 CD3 마이크로비드를 사용하여 분리 단계를 반복하여 T 림프구를 얻습니다. CD3 양성 T 세포와 CD14 양성 단핵구를 포함하는 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 펠릿을 RP5 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다.
혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 250만 개의 단핵구와 500만 개의 T 세포를 새로운 원심분리기 튜브에 추가합니다. 세포를 펠릿화하고 20마이크로리터의 MiR05에 다시 현탁시킵니다.
형광 센서를 설치하고 실험 시작 file O2K 호흡계 장치에서 . AMR 필터 세트와 함께 녹색 LED 형광 센서를 사용하여 형광계 게인과 강도를 1000으로 조정합니다. 챔버 부피를 0.5밀리리터로 설정하고 레이아웃을 조정하여 산소 플럭스와 TMRM 형광을 모두 확인합니다.
산소 플럭스가 안정되면 제조업체의 프로토콜에 따라 공기 산소 보정을 수행합니다. 스토퍼를 닫아 챔버를 밀봉합니다. Hamilton 주사기를 사용하여 2.5마이크로리터의 0.05밀리몰 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM)를 4회 주입합니다.
TMRM의 0, 0.25, 0.5, 0.75 및 1.0 마이크로몰을 나타내는 각 주입에 대한 형광 신호로 유량 센서를 보정합니다. 20마이크로리터의 MiR05를 주입하여 블랭크 실험을 실행합니다. 산소 플럭스가 안정화된 후 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 프리셀로 레이블을 지정합니다.
세포를 포함하는 세포 현탁액 20 마이크로 리터를 주입하고 약 10 분 동안 측정합니다. 그런 다음 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하여 셀로 레이블을 지정합니다. 그런 다음 각 처리에 대해 단계를 순차적으로 반복하고 산소 플럭스와 TMRM 신호에 적절하게 레이블을 지정합니다.
산소 플럭스가 안정되면 1.25 밀리몰 안티마이신 A 1마이크로리터를 주입하여 미토콘드리아 호흡을 억제합니다. 각 빈 실험에 대해 사전 표본 TMRM 농도를 1로 설정하여 배경 비율을 계산합니다. 모든 빈 실험에서 TMRM의 후속 비례 감소와 평균 배경 비율을 계산합니다.
그런 다음 샘플 실험의 사전 샘플 TMRM에 각 샘플 실험의 각 주입에 대한 평균 배경 비율을 곱합니다. 표본의 측정된 TMRM 값에서 실험의 배경을 뺍니다. 다음으로, 각 주입에서 FCCP 배경 보정 미토콘드리아 막 전위를 뺍니다.
ADP 기반 감소를 정규화하려면 가장 높은 멤브레인 전위와 가장 낮은 멤브레인 전위를 각각 100%와 0%로 설정하고 데이터를 비선형 피팅 회귀 모델에 피팅합니다. ADP에 의한 T 세포와 건강한 지원자의 단핵구 변화에 대한 비교 연구는 단핵구가 T 세포에 비해 미토콘드리아 막 전위의 더 큰 손실을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 미토콘드리아 막 전위에 대한 ADP의 절반 최대 억제 농도는 T 세포에 비해 단핵구에 대해 더 낮았습니다.
ADP에 따른 산소 소비율의 일반적인 용량 반응 증가는 두 세포 유형 모두에서 감지되지 않았습니다.
