For å begynne, installer 0,5 ml kamre i O2K-respirometeret i henhold til produsentens instruksjoner. Slå på instrumentet og koble det til den medfølgende programvaren for datainnsamling. Vask kamrene tre ganger med avionisert vann.
Bytt ut vannet med 0.54 ml MiR05 og lukk proppene helt. Etter å ha fjernet overflødig buffer, løft proppene slik at romoksygen kan komme i likevekt med kammeroksygen. Plasser en kolonne i magnetfeltet til en magnetisk celleseparator og vask kolonnen med tre milliliter RP5.
Resuspender den nyisolerte mononukleære cellen i perifert blod, eller PBMC-pellet, i 80 mikroliter RP5, sammen med 20 mikroliter anti-CD14-mikroperler. Inkuber cellene i 15 minutter ved fire grader Celsius. Fortynn cellene med en milliliter RP5 før du legger suspensjonen på kolonnen.
Samle umerkede celler som strømmer gjennom i et 15 milliliter konisk rør merket som strømning gjennom en"Vask kolonnen tre ganger med tre milliliter RP5 for å samle strømmen gjennom væske. Fjern søylen forsiktig fra magnetfeltet og plasser den på et nytt 15 ml konisk rør. Etter å ha tilsatt fem milliliter RP5, skyv stempelet inn i kolonnen for å samle innholdet i røret.
Etter å ha sentrifugert strømmen gjennom ett rør, gjenta isolasjonstrinnene ved å bruke anti-CD3-mikroperler med cellene for å oppnå T-lymfocytter. Sentrifuger cellene som inneholder CD3-positive T-celler og CD14-positive monocytter. Etter å ha kastet supernatanten, suspender pelleten på nytt i en milliliter RP5.
Bruk et hemocytometer til å bestemme cellekonsentrasjonen. Legg til 2,5 millioner monocytter og 5 millioner T-celler i nye sentrifugerør. Pellet cellene og suspender dem på nytt i 20 mikroliter MiR05.
Installer de fluorescerende sensorene og start en eksperimentell fil på O2K-respirometerenheten. Bruk de grønne LED-fluorescerende sensorene, med AMR-filteret innstilt, juster fluorometerforsterkningen og intensiteten til 1000. Sett kammervolumet til 0.5 milliliter og juster oppsettet for å se både oksygenfluks og TMRM-fluorescens.
Når oksygenfluksen er stabil, utfør luftoksygenkalibreringen i henhold til produsentens protokoll. Lukk proppene for å tette kammeret. Bruk en Hamilton-sprøyte til å injisere 2,5 mikroliter 0,05 millimolar tetrametylrhodaminmetylester, eller TMRM, fire ganger.
Kalibrer strømningssensoren med et fluorescerende signal for hver injeksjon som representerer 0, 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 mikromolar TMRM. Injiser 20 mikroliter MiR05 for å kjøre det tomme eksperimentet. Etter at oksygenfluksen har stabilisert seg, velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet som pre-celle.
Injiser 20 mikroliter av cellesuspensjonen som inneholder cellene og mål i ca. 10 minutter. Velg og merk deretter både oksygenfluksen og TMRM-signalene som celler. Gjenta deretter trinnene for hver behandling sekvensielt og merk oksygenfluksen og TMRM-signalet på riktig måte.
Når oksygenfluksen er stabil, injiser du en mikroliter 1,25 millimolar antimycin A for å hemme mitokondriell respirasjon. For hvert blankeksperiment, sett pre-sample TMRM-konsentrasjonen til én for å beregne bakgrunnsforholdet. Beregn den påfølgende proporsjonale reduksjonen i TMRM og gjennomsnittlig bakgrunnsforhold fra alle blanke eksperimenter.
Multipliser deretter pre-sample TMRM for prøveeksperimentet med gjennomsnittlig bakgrunnsforhold for hver injeksjon av hvert prøveeksperiment. Trekk eksperimentets bakgrunn fra de målte TMRM-verdiene til prøven. Deretter trekker du det FCCP-bakgrunnskorrigerte mitokondriemembranpotensialet fra hver injeksjon.
For å normalisere den ADP-drevne reduksjonen, sett det høyeste og laveste membranpotensialet til henholdsvis 100 % og 0 %, og pass dataene inn i en ikke-lineær tilpasningsregresjonsmodell. Sammenlignende studier på ADP-drevne endringer i T-celler og monocytter fra friske frivillige viste at monocytter viste større tap av mitokondrielt membranpotensial sammenlignet med T-celler. Den halve maksimale hemmende konsentrasjonen av ADP på mitokondriemembranpotensialet var lavere for monocytter sammenlignet med T-cellene.
En typisk doseresponsøkning i oksygenforbruksrater med ADP ble ikke påvist i noen av celletypene.