Для начала установите в респирометр О2К 0,5 миллилитровые камеры согласно инструкции производителя. Включите прибор и подключите его к предоставленному программному обеспечению для сбора данных. Трижды промойте камеры деионизированной водой.
Замените воду на 0,54 миллилитра MiR05 и полностью закройте пробки. После удаления излишков буфера поднимите пробки, чтобы кислород в помещении смог сбалансироваться с кислородом в камере. Поместите колонку в магнитное поле магнитного сепаратора и промойте колонку тремя миллилитрами RP5.
Повторно суспендируйте только что выделенную мононуклеарную клетку периферической крови, или гранулу PBMC, в 80 микролитрах RP5 вместе с 20 микролитрами анти-CD14 микрогранул. Инкубируйте клетки в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Разбавьте ячейки одним миллилитром RP5 перед загрузкой суспензии на колонку.
Соберите немеченные клетки, которые протекают в коническую трубку объемом 15 миллилитров, помеченную как «Поток через единицу»Промойте колонку три раза тремя миллилитрами RP5, чтобы собрать поток через жидкость. Осторожно извлеките колонку из магнитного поля и поместите ее на новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавив пять миллилитров RP5, вставьте поршень в колонку, чтобы собрать содержимое в трубку.
После центрифугирования потока через одну пробирку повторите этапы выделения с помощью анти-CD3 микрогранул с клетками для получения Т-лимфоцитов. Центрифугируйте клетки, содержащие CD3-положительные Т-клетки и CD14-положительные моноциты. Выбросив надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре RP5.
С помощью гемоцитометра определяют концентрацию клеток. Добавьте 2,5 миллиона моноцитов и 5 миллионов Т-клеток в новые центрифужные пробирки. Гранулируйте клетки и повторно суспендируйте их в 20 микролитрах MiR05.
Установите флуоресцентные датчики и запустите экспериментальный файл на респирометре O2K. С помощью зеленых светодиодных флуоресцентных датчиков, с набором фильтров AMR, отрегулируйте усиление и интенсивность флуориметра до 1000. Установите объем камеры на 0,5 миллилитра и отрегулируйте схему, чтобы увидеть как поток кислорода, так и флуоресценцию TMRM.
Как только поток кислорода стабилизируется, выполните калибровку кислорода воздуха в соответствии с протоколом производителя. Закройте пробки, чтобы герметизировать камеру. С помощью шприца Гамильтона введите 2,5 микролитра 0,05 миллимолярного метилового эфира тетраметилродамина, или TMRM, четыре раза.
Откалибруйте датчик расхода с помощью флуоресцентного сигнала для каждой инъекции, представляющей 0, 0,25, 0,5, 0,75 и 1,0 микромоляра TMRM. Введите 20 микролитров MiR05, чтобы запустить эксперимент с холостым патроном. После того как поток кислорода стабилизируется, выберите и пометьте поток кислорода и сигнал TMRM в качестве предварительной ячейки.
Введите 20 микролитров клеточной суспензии, содержащей клетки, и отмерьте около 10 минут. Затем выберите и пометьте поток кислорода и сигналы TMRM как ячейки. Затем повторяйте шаги для каждой процедуры последовательно и соответствующим образом обозначьте поток кислорода и сигнал TMRM.
Как только поток кислорода стабилизируется, введите один микролитр 1,25 миллимолярного антимицина А, чтобы подавить митохондриальное дыхание. Для каждого эксперимента с пустым образцом установите предварительную концентрацию TMRM равным единице, чтобы рассчитать фоновое отношение. Рассчитайте последующее пропорциональное уменьшение TMRM и среднего фонового коэффициента по всем холостым экспериментам.
Затем умножьте TMRM образца эксперимента с образцом на средний фоновый коэффициент для каждой инъекции в каждом эксперименте с образцом. Вычтите фон эксперимента из измеренных значений TMRM образца. Затем вычтите скорректированный на фон FCCP потенциал митохондриальной мембраны от каждой инъекции.
Чтобы нормализовать снижение, вызванное АДФ, установите максимальный и самый низкий мембранный потенциал равными 100% и 0% соответственно и подогнайте данные к модели нелинейной регрессии аппроксимации. Сравнительные исследования изменений, вызванных АДФ, в Т-клетках и моноцитах у здоровых добровольцев показали, что моноциты демонстрируют большую потерю потенциала митохондриальной мембраны по сравнению с Т-клетками. Половинная максимальная ингибиторная концентрация АДФ на потенциале митохондриальной мембраны была ниже для моноцитов по сравнению с Т-клетками.
Типичное увеличение дозовой реакции при потреблении кислорода при АДФ не было обнаружено ни в одном из типов клеток.
