Till att börja med, installera 0.5 milliliter kammare i O2K-andningsindikatorn enligt tillverkarens instruktioner. Slå på instrumentet och anslut det till den medföljande programvaran för datainsamling. Tvätta kamrarna tre gånger med avjoniserat vatten.
Byt ut vattnet mot 0.54 ml MiR05 och stäng propparna helt. Efter att ha tagit bort överskottsbufferten, höj propparna så att syret i rummet kan komma i jämvikt med syre i kammaren. Placera en pelare i magnetfältet i en magnetisk cellseparator och tvätta kolonnen med tre milliliter RP5.
Återsuspendera den nyligen isolerade mononukleära cellen i perifert blod, eller PBMC-pelleten, i 80 mikroliter RP5, tillsammans med 20 mikroliter anti-CD14-mikrokulor. Inkubera cellerna i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Späd cellerna med en milliliter RP5 innan suspensionen laddas på kolonnen.
Samla omärkta celler som strömmar igenom i ett 15 milliliter koniskt rör märkt som flöde genom ett"Tvätta kolonnen tre gånger med tre milliliter RP5 för att samla upp flödet genom vätska. Ta försiktigt bort kolonnen från magnetfältet och placera den på ett nytt 15 milliliter koniskt rör. Efter att ha tillsatt fem milliliter RP5, tryck in kolven i kolonnen för att samla upp innehållet i röret.
Efter centrifugering av flödet genom ett rör, upprepa isoleringsstegen med anti-CD3-mikropärlor med cellerna för att erhålla T-lymfocyter. Centrifugera cellerna som innehåller CD3-positiva T-celler och CD14-positiva monocyter. Efter att ha kasserat supernatanten, suspendera pelleten igen i en milliliter RP5.
Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer. Tillsätt 2,5 miljoner monocyter och 5 miljoner T-celler i nya centrifugrör. Pelletera cellerna och suspendera dem igen i 20 mikroliter MiR05.
Installera de fluorescerande sensorerna och starta en experimentell fil på O2K-andningsenheten. Använd de gröna LED-lysrörssensorerna, med AMR-filtersetet, justera fluorometerns förstärkning och intensiteten till 1000. Ställ in kammarvolymen på 0,5 milliliter och justera layouten för att se både syreflöde och TMRM-fluorescens.
När syreflödet är stabilt, utför kalibreringen av luftsyre enligt tillverkarens protokoll. Stäng propparna för att täta kammaren. Använd en Hamilton-spruta och injicera 2,5 mikroliter 0,05 millimolar tetrametylrhodaminmetylester, eller TMRM, fyra gånger.
Kalibrera flödessensorn med en fluorescerande signal för varje injektion som representerar 0, 0,25, 0,5, 0,75 och 1,0 mikromolar TMRM. Injicera 20 mikroliter MiR05 för att köra blindexperimentet. Efter att syreflödet har stabiliserats, välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen som förcell.
Injicera 20 mikroliter av cellsuspensionen som innehåller cellerna och mät i cirka 10 minuter. Välj sedan ut och märk både syreflödet och TMRM-signalerna som celler. Upprepa sedan stegen för varje behandling sekventiellt och märk syreflödet och TMRM-signalen på lämpligt sätt.
När syreflödet är stabilt, injicera en mikroliter 1,25 millimolar antimycin A för att hämma mitokondriell andning. För varje blankprovsexperiment, ställ in TMRM-koncentrationen före provet till ett för att beräkna bakgrundsförhållandet. Beräkna den efterföljande proportionella minskningen av TMRM och det genomsnittliga bakgrundsförhållandet från alla blindförsök.
Multiplicera sedan TMRM före provet från provexperimentet med det genomsnittliga bakgrundsförhållandet för varje injektion i varje provexperiment. Subtrahera experimentets bakgrund till de uppmätta TMRM-värdena för provet. Subtrahera sedan den FCCP-bakgrundskorrigerade mitokondriella membranpotentialen från varje injektion.
För att normalisera den ADP-drivna minskningen anger du den högsta och lägsta membranpotentialen som 100 % respektive 0 % och passar in data i en icke-linjär passningsregressionsmodell. Jämförande studier av ADP-drivna förändringar i T-celler och monocyter från friska frivilliga visade att monocyter uppvisade större förlust av mitokondriell membranpotential jämfört med T-celler. Den halva maximala hämmande koncentrationen av ADP på mitokondriell membranpotential var lägre för monocyter jämfört med T-celler.
En typisk dos-responsökning av syrekonsumtionen med ADP upptäcktes inte i någon av celltyperna.