Başlamak için, E3 tamponunda anestezi uygulanmış zebra balığı embriyoları elde edin. İstenilen floresansa sahip embriyoları seçtikten sonra, kalp atışlarını parlak alan stereo mikroskobu altında görselleştirin. Geniş uçlu bir transfer pipeti kullanarak, üç adede kadar embriyo çizin ve bunları bir alt cam görüntüleme plakasına aktarın.
Stereo mikroskop altında, bir pipet kullanarak, embriyoların etrafındaki ortamı% 1 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi ile değiştirin. Bir alay iğnesine bağlı plastik ince konik bir uç kullanarak, her embriyoyu görüntüleme plakasının altına hafifçe itin ve sırt tarafını cama bakacak şekilde yönlendirin. Embriyoyu ters çevrilmiş bir konfokal mikroskoba monte edin.
Hızlandırılmış çekim parametrelerini ayarladıktan sonra görüntüleri alın. Imaris dosya dönüştürücü yazılımını açın ve dosyaları giriş alanına sürükleyip bırakın. Çıktı menüsünde, dönüştürülen dosyaların konumunu belirleyin.
Doğrulamak için ayarlanan voksel boyutuna tıklayın ve dosya dönüştürmeyi IMS formatına başlatmak için Tümünü başlat düğmesine basın. Başlatıldıktan sonra, analiz yazılımının arenada başlamasına izin verin. Daha önce dönüştürülen dosyayı açmak için Klasörü Gözlemle'ye tıklayın.
Dosya yazılıma yüklendikten sonra, Dilim z yığınında gezinmek için view . Dilim araç çubuğundaki kaydırıcıyı kullanarak, işaretçiyle seçilen hücrelerin çapını çizdikten sonra hücre çaplarını ölçün. Hücre çekirdeğini kapsayan parçalar çizmek için fareyi tıklatıp sürükleyin ve görünüm alanının sağında yer alan ölçü araç çubuğunda çizilen parçanın uzunluğuna bakın.
Hücreleri otomatik olarak algılamak için 3B görünüme geri dönün ve Nesne listesine yeni bir Spot nesnesi eklemek için nesne araç çubuğundaki Spot simgesine tıklayın ve Otomatik Spot Oluşturma Sihirbazı'nı açın. Sihirbazın ilk adımında, yalnızca bir ilgi alanını segmentlere ayırma seçeneğini kullanın. Ardından, izleme verilerini hesaplamak için Zaman İçinde Noktaları İzle seçeneğini ve noktalar arasında karşılaştırmaya izin vermek ve veri aralığını genişletmek için Nesne-Nesne İstatistiklerini etkinleştirin.
Sihirbaz penceresinin sağ alt köşesindeki ileri düğmesine tıklayın. Embriyonun optik tektumunu çevreleyen bir ilgi alanı veya ROI alanı belirtin. ROI'nin boyutunu değiştirmek için her bir yüzünde bulunan küçük beyaz okları tıklayın ve sürükleyin.
Ardından, zaman aralığı ayarlamaları ile kaydedilen tüm karelere genişletin. Ardından bir kaynak kanalı seçin ve daha önce elde edilen hücre çapı ölçümünü tahmini XY çapı olarak ayarlayın. Arka Plan Çıkarma seçeneğini etkinleştirin ve İleri'ye tıklayın.
Tüm hücrelerin algılanmasını sağlamak için yoğunluk eşik değerlerini doğrudan alt ve üst eşik kutularına girin. Tüm bu değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için Alanı Görüntüle'ye tıklayın. Memnun kaldığınızda, seçilen kalite eşiğini doğrulamak için İleri'ye tıklayın ve kaynak kanalda üst üste bindirilmiş bu iki parametreyi karşılayan noktaları görselleştirmek için Alanı Görüntüle'ye tıklayın.
Ardından, az ya da çok sürekli harekete sahip hücreleri izlemek için izleme algoritması olarak Otoagresif Hareket'i seçin. Bir hücrenin iki zaman noktası arasındaki en uzun mesafeyi değerlendirmek için iki kare arasındaki noktaların hareketini gözlemleyin ve maksimum mesafe alanına tahmini bir sayı girin. Maksimum boşluk boyutunu ayarlamak için, kareler arasındaki aralık 60 saniyenin altındaysa, üç boyutunu kullanın ve daha uzun zaman aralıkları için aynısını artırın.
Algılama eşiğini düşürmek ve parçaları bağlamak için algılanan tüm nesnelerle boşlukları doldurmayı etkinleştirin. Ardından İleri'ye tıklayın ve yazılımın önceden oluşturulmuş tüm noktalar için otomatik olarak parçalar oluşturmasına izin verin. Elde edilen parçalar çok sayıda veya parçalıysa, Önceki düğmesiyle Oluşturma Sihirbazı'na dönün ve önceden tanımlanan maksimum mesafeyi ayarlayın.
Üç ila sekiz dakikadan kısa parçaları hariç tutmak için, parça süresi filtresinin alt sınırının değerini doğrudan veri alanına girin. Filtreyi doğrulamak için İleri'ye tıklayın ve Oluşturma Sihirbazı'na geçin. Beyin parankimal mikrogliasına odaklanmak için cilt makrofajlarından üretilen izleri analizden manuel olarak çıkarın.
Track Editor'ı kullanarak parçalardaki diğer olası hataları manuel olarak düzeltin. Görüntüleme alanının sağ tarafında, daire Seç Modu düğmesini etkinleştirin ve değişiklik veya ayarlama gerektiren parçaları vurgulayın. Sorunlu parça seçildikten sonra, Bağlan ve Bağlantıyı Kes düğmelerini kullanarak, hücre hareketlerini doğru bir şekilde temsil edecek şekilde düzenleyin.
Track Editor ile, yinelenen tek noktaları silmek için Daire Seçimi Modu'nu seçin. Mikroglia raporlayıcıyı diğer floresan etiketli parankimal hücrelerle kullanıyorsanız, tahmini XY çapını ve yeni hücre popülasyonuna olan maksimum mesafeyi ayarlayın. Görüntüye kaynak kanal girişini değiştirin.
Son olarak, İstatistik sekmesini kullanarak istediğiniz izleme istatistiklerini çıkarın. Ayarlar düğmesine tıklayın ve daha önce oluşturulan her bir spot nesnenin veya yüzey nesnesinin hesaplanması için istatistikleri seçin. Embriyonik zebra balığının beyni bütünüyle görüntülendi ve nöronların mikrogliaya göre konumu görselleştirildi.
Bu protokol kullanılarak elde edilen uzamsal veriler, mikroglial hücrelerin ortalama hızını, bir saatte kat ettikleri ortalama mesafeyi, ortalama kare yer değiştirmelerini ve farklı zamanlarda uzaydaki dağılımlarını gösterir.
