Efter at have udført immunhistokemi på FFPE-vævene, skal du afbilde sektionerne ved hjælp af det digitale patologibillede. Start softwaren for at udføre spektral afblanding af de kommenterede billeder. Vælg File, klik derefter på Åbn billede, og vælg QPTIFF files for at uploade billederne til softwaren.
Tillad de stempler, der er markeret som informerede projekter, at uploade til projektet. Indlæs QPTIFF-filerne, der er forberedt til autofluorescenskompensationen. Vælg autofluorescens på billedværktøjet for at tegne en streg på billedet fra det ufarvede dias gennem autofluorescerende strukturer som erytrocytter og kollagen for at kompensere for autofluorescens.
Naviger derefter til Rediger markører og farver afsnit. Tildel markørnavne, der matcher Opal-fluoroforen, og juster farveindstillingerne til din foretrukne indstilling. Vælg Forbered alle i nederste venstre hjørne af grænsefladen for at starte opblandingen af fluoroforer.
Undersøg alle billeder for at kontrollere synligheden af alle signaler og den vellykkede afslutning af afblandingsprocessen. Vælg øjeæbleikonet for at slukke og tænde alle markørerne én efter én for at kontrollere kvaliteten. Naviger nu til eksport fanen og opret en ny tom eksportmappe ved at klikke på Gennemse knappen placeret under eksportmappen.
Vælg sammensat billede og komponentbilleder TIFF med flere billeder under fanen billeder, der skal eksporteres. Gå til fanen Batchanalyse, der findes lodret til venstre for batchbehandling af slides, og vælg opret separate mapper for hvert element under eksportindstillingerne. Hvis du vil tilføje dias til analyse, skal du vælge QPTIFF-filer under knappen Tilføj dias og indlæse disse i batchanalysen.
Vælg Kør for at starte batchbehandlingen af dias. Opret en ny mappe, der kun indeholder komponentfilerne fra spektral unmixing, og sørg for, at den hierarkiske mappestruktur forbliver intakt. Start hele diasfremvisersoftwaren.
Klik på Opret projekt i venstre side, og opret eller vælg en ny tom mappe med et passende navn. Klik derefter på Automatiser, og vælg Vis scripteditor. Kopiér og indsæt det eksisterende script, og rediger placeringen for at dirigere det mod den mappe, der indeholder alle slidekomponentfilerne.
Vælg Kør for at starte processen med batchsammenføjning af dias, og lad den derefter fuldføre. Flyt nu de nyligt genererede OME TIFF-filer til QuPath-projektet, og gem dem som et nyt projekt. Når et nyt vindue vises, skal du vælge Indstil billedtype som fluorescens og derefter klikke på knappen Importer.
Naviger til menuen til venstre, vælg en prøve fra listen, og dobbeltklik for at åbne den valgte prøve. Juster intensiteten af kanalerne ved at klikke på ikonet Kontrast for at øge synligheden. Vælg alle kanaler, og vælg at nulstille.
Sørg for, at autofluorescensen er slået fra. Hvis du vil tegne et område af interesse eller investeringsafkast for tumoren, skal du klikke på kontrastikonet igen og derefter vælge Vis gråtoner. Vælg derefter tumormarkørkanalen og juster intensiteten for optimal synlighed.
Klik på penselværktøjet for at tegne et ROI omkring tumoren. Klik på det ene værktøj, og juster ROI, mens du trykker på alt-tasten for at udjævne ROI udefra. Når du er færdig, skal du flette alle adskilte dele af tumoren til den samme ROI.
Højreklik på ROI-anmærkningen på listen til venstre, vælg Angiv egenskaber, og angiv et passende navn. For eksempel tumor. Udvid ROI for den invasive margin fra tumorregionen ved at vælge Objekter og derefter Anmærkninger efterfulgt af Udvid anmærkninger.
Vælg den ønskede størrelse til ekspansionsradius. Vælg fjern indvendig og begræns til overordnet. Klik på kontrastikonet, vælg autofluorescenskanalen og juster intensiteten for optimal synlighed.
Klik på tryllestaven og juster ROI, mens du trykker på alt-tasten for at udjævne ROI udefra og fjerne enhver baggrund, der ikke bør være en del af denne ROI. Højreklik på anmærkningen på listen til venstre. Vælg derefter Angiv egenskaber for at tildele et passende navn, f.eks. invasiv margen eller chat, til ROI.
Hvis det ønskes, kan du ændre dens farve. For at eksportere anmærkningerne skal du navigere til indstillingen Filer, klikke på Objektdata, Eksporter som GeoJSON og vælge Eksporter alle objekter. Fortsæt med standardvalget ved eksport som funktionssamling, og gem det på en foretrukken placering.