Pour commencer, placez la souris euthanasiée en position couchée sur le banc propre. Coupez le long de la ligne médiane de l’abdomen de la souris et séparez les structures abdominales couche par couche. À l’aide d’une pince à épiler, ouvrez doucement le gros épiploon et l’estomac.
Ensuite, retirez doucement la rate avec le ligament gastro-splénique et séparez-la brusquement des tissus et ligaments environnants pour obtenir une rate intacte. Placez un filtre cellulaire de 70 microns dans une boîte de culture stérile de 100 millimètres. Ajoutez la rate dans la passoire cellulaire et écrasez-la avec un piston de seringue.
Ajoutez cinq à huit millilitres de liquide de rinçage homogéné pour pousser les cellules spléniques à travers le filtre dans la boîte de culture. Centrifugez le filtrat à 450 g pendant cinq minutes à température ambiante et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension avec le diluant de l’échantillon fourni avec le kit de séparation des lymphocytes.
Après avoir compté les cellules sur un hémocytomètre, ajustez la concentration cellulaire à 2 X 10 à la puissance huit cellules par millilitre. Dans un tube à centrifuger, prenez la même quantité de solution de séparation des lymphocytes que la suspension de cellules uniques de tissus. Pipetez soigneusement la suspension unicellulaire sur la surface de la solution de séparation des lymphocytes et centrifugez-la à 800 g pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius.
Après la centrifugation, observez les quatre couches du tube de haut en bas. À l’aide d’une pipette, aspirez soigneusement la couche annulaire de lymphocytes blanc laiteux dans un autre tube. Ajoutez 10 millilitres de solution de nettoyage dans le tube pour mélanger les cellules.
Centrifugez la suspension cellulaire à 250 g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu RPMI 1640 pour le comptage cellulaire.
