Başlamak için, ötenazi yapılmış fareyi temiz tezgahın üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Fare karnının orta hattı boyunca kesin ve karın yapılarını katman katman ayırın. Cımbız kullanarak, büyük omentum ve mideyi nazikçe açın.
Daha sonra dalağı gastrosplenik ligament ile nazikçe dışarı çekin ve sağlam bir dalak elde etmek için çevre dokulardan ve ligamentlerden künt bir şekilde ayırın. 70 mikronluk bir hücre filtresini 100 milimetrelik steril bir kültür kabına yerleştirin. Dalağı hücre süzgecine ekleyin ve bir şırınga pistonu ile ezin.
Dalak hücrelerini filtreden kültür kabına itmek için beş ila sekiz mililitre homojenat yıkama sıvısı ekleyin. Süzüntüyü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Lenfosit ayırma kiti ile birlikte verilen numune seyreltici ile peleti yeniden askıya alın.
Bir hemositometredeki hücreleri saydıktan sonra, hücre konsantrasyonunu mililitre başına sekiz hücrenin gücüne 2 X 10 olarak ayarlayın. Bir santrifüj tüpünde, doku tek hücreli süspansiyonu ile aynı miktarda lenfosit ayırma çözeltisi alın. Tek hücreli süspansiyonu lenfosit ayırma çözeltisinin yüzeyine dikkatlice pipetleyin ve 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca 800 g'da santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra, tüpteki dört katmanı yukarıdan aşağıya doğru gözlemleyin. Bir pipet kullanarak, halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakasını dikkatlice başka bir tüpe çekin. Hücreleri karıştırmak için tüpe 10 mililitre temizleme solüsyonu ekleyin.
Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 250 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre sayımı için peleti 10 mililitre RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
