Rening och analys av möss naiva CD4⁺ T-celler med hjälp av magnetisk pärlbaserad negativ selektion

För att börja, förbered en mus mjält encellssuspension med en gånger 10 potensen av åtta celler per milliliter i en volym av 0,1 till två milliliter. Tillsätt 50 mikroliter råttserum till provet. Överför provet till ett fem milliliter polystyren runt bottenrör.

Tillsätt 50 mikroliter isoleringscocktail till provet. Blanda väl och inkubera i 7,5 minuter i rumstemperatur. Tillsätt nu 50 mikroliter per milliliter utarmningscocktail.

Blanda väl och inkubera i 2,5 minuter. Virvla under tiden de magnetiska pärlorna för att säkerställa jämn spridning. Tillsätt 75 mikroliter av de magnetiska pärlorna till provet.

Blanda väl och inkubera i 2,5 minuter. Fyll på provet med RPMI 1640 medium till en slutlig volym på 2,5 milliliter och blanda flera gånger. Placera sedan röret i magneten i 2,5 minuter.

Plocka upp magneten och vänd upp och ner på den med röret i en kontinuerlig rörelse, häll den berikade cellsuspensionen i ett nytt rör. Bestäm cellnumret med hjälp av en hemocytometer. Utför flödescytometrisk analys för naiv CD fyra positiva T-celler före och efter isolering.

Efter gating, överför cellsuspensionen till ett nytt centrifugrör. Centrifugera vid 400 G i fem minuter och kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 200 till 500 mikroliter RPMI 1640 medium kompletterat med 10%FBS.

För varje milliliter cellkultur, tillsätt två mikroliter leukocytaktiveringscocktail och blanda. Odla cellerna i en koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius med mättad luftfuktighet i fyra till sex timmar.