بعد معايرة نظام قياس التنفس ، استبدل MiR05 من كل غرفة ب 2.1 ملليلتر جديد من محلول MiR05. في برنامج قياس التنفس ، أدخل إعدادات الجهاز. قم بتعيين اسم الملف وحفظ الإعدادات.
في مربع الحوار التالي، أدخل معلومات العينة، بما في ذلك وزن كل عينة مضافة إلى كل غرفة. الآن ، افتح نافذة معايرة الأكسجين ، وانقر فوق نسخ من ملف ، وحدد ملف معايرة الهواء المحفوظ. ثم ، انقر فوق الزر معايرة ونسخ إلى الحافظة.
باستخدام ملقط دقيق ، انقل بعناية حزم الألياف العضلية ، المعزولة مسبقا عن الماوس ، إلى محلول التنفس. ضع السدادات على الحجرة وادفعها في منتصف الطريق تقريبا إلى الأسفل لإغلاق الحجرة بشكل شبه كامل. بمجرد تعشيق الحلقات O الموجودة على السدادات مع جدار الحجرة ، استخدم حركة التواء أثناء الضغط لأسفل للإغلاق.
عندما تكون الغرفة مغلقة في منتصف الطريق ، يتم ملاحظة فقاعة هواء صغيرة في الجزء العلوي من الغرفة. املأ حقنة بلاستيكية سعة 10 ملليلتر بالأكسجين النقي من خزان الأكسجين. ضع الإبرة الطويلة غير الحادة على المحقنة ، ثم أدخل الإبرة في الحجرة الأولى وقم بتوصيل ما يقرب من ملليلتر من الأكسجين ببطء.
مراقبة تركيز الأكسجين في الغرفة. عندما يصل التركيز إلى 350 إلى 400 نانومول لكل ملليلتر ، قم بلف السدادة برفق أثناء الضغط لأسفل لإغلاق الحجرة بالكامل. راقب الغرفة وتأكد من عدم بقاء فقاعات هواء.
لتطبيع بيانات تدفق الأكسجين إلى كتلة الأنسجة من قائمة التخطيط ، حدد تخطيط 06 تدفق محدد لكل وحدة تخطيط عينة. تأكد من استقرار تركيز الأكسجين وتدفق الأكسجين بعد إضافة الأكسجين لبدء قياس التنفس. باستخدام حقنة زجاجية سعة 10 ميكرولتر ، أضف 2.5 ميكرولتر من 0.8 مولار مالات إلى كل غرفة.
اضغط على F4 لتحديد الجدول الزمني ، وقم بتسمية العلامة ب M.Record تدفق الأكسجين المستقر لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بالنسبة للسكر الهوائي ، أضف 10 ميكرولترات من اثنين من الغلوتامات المولية وخمسة ميكرولترات من اثنين من البيروفات المولية إلى كل غرفة. اضغط على F4 لوضع علامة على المخطط الزمني ، وقم بتسمية العلامة باستخدام GP. سجل تدفق الأكسجين المستقر لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
أضف 10 ميكرولتر من 2 غلوتامات مولية و 10 ميكرولتر من 10 مليمول بالميتويل كارنيتين إلى كل غرفة لركائز الأحماض الدهنية. اضغط على F4 لوضع علامة على المخطط الزمني، وقم بتسمية العلامة باستخدام GPC. سجل تدفق الأكسجين المستقر لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
باستخدام حقنة زجاجية سعة 25 ميكرولتر ، أضف 20 ميكرولترا من 0.5 مولار ADP إلى كل غرفة. اضغط على F4 لوضع علامة على المخطط الزمني، وقم بتسمية العلامة باستخدام ADP. سجل تدفق الأكسجين المستقر لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
الآن ، أضف 20 ميكرولترا من سكسينات مولار واحدة إلى كل غرفة. اضغط على F4 لتحديد المخطط الزمني ، وقم بتسمية العلامة بتدفق الأكسجين المستقر S.Record لمدة دقيقة إلى دقيقتين. باستخدام حقنة زجاجية سعة 10 ميكرولتر ، أضف خمسة ميكرولتر من أربعة مللي مولار سيتوكروم ج إلى كل غرفة.
اضغط على F4 لوضع علامة على المخطط الزمني، وقم بتسمية العلامة بالسيتوكروم c. سجل تدفق الأكسجين المستقر لمدة دقيقة إلى دقيقتين. قم بالمعايرة في 3 جرعات ميكرولتر واحد من FCCP الملي واحد ، باستخدام حقنة زجاجية سعة 10 ميكرولتر.
ينتج عن إصدار FCCP انخفاض قصير في مستويات تدفق الأكسجين. انتظر حتى يزداد تدفق الأكسجين ويستقر قبل التسجيل. اضغط على F4 لوضع علامة على المخطط الزمني، وعلامة التسمية باستخدام FCCP.
سجل تدفق الأكسجين المستقر لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بمجرد اكتمال الفحص ، قم بلف السدادة برفق وسحبها لأعلى لإزالتها. شطف الغرفة ثلاث مرات بالماء النقي ، تليها ثلاث مرات مع 70 ٪ من الإيثانول.
ضع السدادات في الغرف حتى تشعر بالمقاومة ، لكن لا تغلقها تماما. ثم قم بتغطية السدادات. احفظ ملف الفحص وافصل الجهاز عن البرنامج.
أخيرا ، قم بإيقاف تشغيل مقياس التنفس. في عينات الفئران المعدة بشكل صحيح ، لم تؤثر إضافة السيتوكروم ج بعد ADP على تدفق الأكسجين ، مما يؤكد سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي. ومع ذلك ، عندما لم يتم تحضير عينات الأنسجة بشكل صحيح ، أدت إضافة السيتوكروم ج بعد ADP إلى زيادة بنسبة 40٪ في تدفق الأكسجين ، مما يشير إلى تلف غشاء الميتوكوندريا الخارجي.
