Vervang na kalibratie van het respirometriesysteem MiR05 uit elke kamer door verse 2.1 milliliter MiR05-oplossing. Voer in de respirometriesoftware de instrumentinstellingen in. Stel de bestandsnaam in en sla de instellingen op.
Voer in het volgende dialoogvenster de monstergegevens in, inclusief het gewicht van elk monster dat aan elke kamer is toegevoegd. Open nu het zuurstofkalibratievenster, klik op kopiëren uit bestand en selecteer het opgeslagen luchtkalibratiebestand. Klik vervolgens op de knop kalibreren en kopiëren naar klembord.
Breng met een fijne pincet voorzichtig spiervezelbundels, eerder geïsoleerd van de muis, over in de ademhalingsoplossing. Plaats de stoppers op de kamer en duw ze ongeveer halverwege naar de bodem om de kamer half te sluiten. Zodra de O-ringen op de stoppers in de kamerwand vastklikken, gebruikt u een draaiende beweging terwijl u naar beneden drukt om te sluiten.
Wanneer de kamer half gesloten is, wordt een kleine luchtbel waargenomen aan de bovenkant van de kamer. Vul een plastic spuit van 10 milliliter met zuivere zuurstof uit een zuurstoftank. Plaats de lange, stompe naald op de spuit, steek de naald vervolgens in de eerste kamer en geef langzaam ongeveer een milliliter zuurstof af.
Bewaak de zuurstofconcentratie in de kamer. Wanneer de concentratie 350 tot 400 nanomol per milliliter bereikt, draait u de stop voorzichtig terwijl u deze naar beneden duwt om de kamer volledig te sluiten. Observeer de kamer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven.
Als u de zuurstoffluxgegevens wilt normaliseren naar de massa van het weefsel in het lay-outmenu, selecteert u de lay-out 06 specifieke flux per eenheid monsterlay-out. Zorg ervoor dat de zuurstofconcentratie en zuurstofflux zijn gestabiliseerd na het toevoegen van zuurstof om de ademhalingsmeting te starten. Voeg met een glazen spuit van 10 microliter 2,5 microliter 0,8 molair malaat toe aan elke kamer.
Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met M.Registreer de stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten. Voeg voor aërobe glycolytic 10 microliter glutamaat van twee molaren en vijf microliter van twee molair pyruvaat toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met GP. Registreer een stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten.
Voeg 10 microliter glutamaat van 2 molaire en 10 microliter van 10 millimolaire palmitoylcarnitine toe aan elke kamer voor vetzuursubstraten. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met GPC. Registreer een stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten.
Voeg met een glazen spuit van 25 microliter 20 microliter ADP van 0,5 molaar toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met ADP. Registreer een stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten.
Voeg nu 20 microliter van één kies succinaat toe aan elke kamer. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met S.Record stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten. Voeg met een glazen spuit van 10 microliter vijf microliter van vier millimolair cytochroom c toe aan elke kamer.
Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label de markering met cytochroom c. Registreer een stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten. Titreer in 3 bolussen van één microliter van één millimolaire FCCP, met behulp van een glazen spuit van 10 microliter.
De FCCP-editie resulteert in een korte afname van de zuurstofflux. Wacht tot de zuurstofflux is toegenomen en gestabiliseerd voordat u opneemt. Druk op F4 om de tijdlijn te markeren en label markeren met FCCP.
Registreer een stabiele zuurstofflux gedurende één tot twee minuten. Zodra de test is voltooid, draait en trekt u de stop voorzichtig omhoog om deze te verwijderen. Spoel de kamer driemaal met ultrapuur water, gevolgd door drie keer met 70%ethanol.
Plaats de stoppers in de kamers totdat u weerstand voelt, maar sluit ze niet volledig. Sluit vervolgens de stoppen af. Sla het analysebestand op en koppel het instrument los van de software.
Schakel ten slotte de ademhalingsmeter uit. In goed voorbereide muizenmonsters had de toevoeging van cytochroom c post-ADP geen invloed op de zuurstofflux, wat de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan bevestigt. Wanneer weefselmonsters echter niet goed waren voorbereid, leidde het toevoegen van cytochroom c post-ADP tot een toename van 40% in de zuurstofflux, wat wijst op schade aan het buitenste mitochondriale membraan.
