Efter kalibrering av respirometrisystemet, byt ut MiR05 från varje kammare mot ny 2.1 ml MiR05-lösning. I andningsprogrammet anger du instrumentinställningar. Ställ in filnamnet och spara inställningarna.
I nästa dialogruta anger du provinformationen, inklusive vikten för varje prov som läggs till i varje kammare. Öppna nu syrekalibreringsfönstret, klicka på kopiera från fil och välj den sparade luftkalibreringsfilen. Klicka sedan på knappen Kalibrera och kopiera till urklipp.
Använd en fin pincett för att försiktigt överföra muskelfiberbuntar, som tidigare isolerats från musen, till andningslösningen. Placera propparna på kammaren och tryck dem ungefär halvvägs till botten för att halvstänga kammaren. När O-ringarna på propparna griper in i kammarväggen, använd en vridande rörelse samtidigt som du trycker nedåt för att stänga.
När kammaren är halvvägs stängd observeras en liten luftbubbla i toppen av kammaren. Fyll en 10 milliliter plastspruta med rent syre från en syrgastank. Placera den långa, trubbiga nålen på sprutan, stick sedan in nålen i den första kammaren och tillför långsamt cirka en milliliter syre.
Övervaka syrekoncentrationen i kammaren. När koncentrationen når 350 till 400 nanomol per milliliter, vrid försiktigt proppen samtidigt som du trycker nedåt för att stänga kammaren helt. Observera kammaren och se till att det inte finns några luftbubblor kvar.
För att normalisera syreflödesdata till massan av vävnad från layoutmenyn, välj layout 06 specifikt flöde per enhet sample layout. Se till att syrekoncentrationen och syreflödet har stabiliserats efter syrgastillsats för att påbörja andningsmätningen. Använd en 10 mikroliters glasspruta och tillsätt 2,5 mikroliter 0,8 molarmalat i varje kammare.
Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk markeringen med M.Record stabilt syreflöde i en till två minuter. För aerob glykolytika, tillsätt 10 mikroliter två molar glutamat och fem mikroliter två molar pyruvat till varje kammare. Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk markeringen med GP. Registrera stabilt syreflöde i en till två minuter.
Tillsätt 10 mikroliter 2 molar glutamat och 10 mikroliter 10 millimolar palmitoylkarnitin till varje kammare för fettsyrasubstrat. Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk markeringen med GPC. Registrera stabilt syreflöde i en till två minuter.
Använd en 25 mikroliters glasspruta och tillsätt 20 mikroliter 0,5 molar ADP till varje kammare. Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk markeringen med ADP. Registrera stabilt syreflöde i en till två minuter.
Tillsätt nu 20 mikroliter av en molar succinat till varje kammare. Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk markeringen med S.Record stabilt syreflöde i en till två minuter. Använd en 10 mikroliters glasspruta och tillsätt fem mikroliter fyra millimolära cytokrom c till varje kammare.
Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk markeringen med cytokrom c. Registrera stabilt syreflöde i en till två minuter. Titrera i 3 enmikroliters bolusar av en millimolär FCCP, med hjälp av en 10 mikroliters glasspruta.
FCCP-utgåvan resulterar i en kortvarig minskning av syreflödesnivåerna. Vänta tills syreflödet ökar och stabiliseras innan du spelar in. Tryck på F4 för att markera tidslinjen och märk med FCCP.
Registrera stabilt syreflöde i en till två minuter. När analysen är klar, vrid försiktigt och dra proppen uppåt för att ta bort den. Skölj kammaren tre gånger med ultrarent vatten, följt av tre gånger med 70 % etanol.
Placera propparna i kamrarna tills motstånd känns, men stäng dem inte helt. Täck sedan propparna. Spara analysen file och koppla bort instrumentet från programvaran.
Stäng slutligen av andningsmätaren. I korrekt preparerade murina prover påverkade inte tillsatsen av cytokrom c efter ADP syreflödet, vilket bekräftar integriteten hos det yttre mitokondriella membranet. Men när vävnadsprover inte förbereddes ordentligt ledde tillsats av cytokrom c efter ADP till en 40-procentig ökning av syreflödet, vilket indikerar skador på det yttre mitokondriella membranet.
