Tümör Ksenotransplantasyonunu Değerlendirmek için Flow Sitometri Analizi için Tek Hücreli Embriyo Süspansiyonunun Hazırlanması

Başlamak için, CM-Dil ile boyanmış lösemi hücreleri enjekte edilmiş zebra balığı embriyoları elde edin. Anestezi uygulanmış embriyoları 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir P200 pipeti kullanarak, yumurta sarısını 100 mikrolitre kalsiyum içermeyen zil çözeltisinde beş dakika boyunca çözün. Sarısı alınmış embriyoların her bir örneğini bir mililitre tripsin kollajenaz çözeltisi ile 29 santigrat derecede 30 ila 35 dakika inkübe edin.

Bir P1000 ucu kullanarak, omurga yapısı artık görünmeyene kadar embriyoları her beş dakikada bir bu solüsyonda yukarı ve aşağı pipetleyin. Reaksiyonu durdurmak için, tüpe 200 mikrolitre FBS ekleyin. İyice karıştırın ve beş dakika daha inkübe edin.

Hücre süspansiyonunu 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca peletleyin. Süpernatan atıldıktan sonra, hücre peletini soğutulmuş PBS'de iki kez yıkayın ve hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Hücreleri yıkadıktan sonra, nakledilen hücrelerle reaktif bir antikor içeren boyama ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin.

Hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri pelet haline getirin ve bir mikromolar sarmal ve P Blue içeren 200 mikrolitre boyama ortamında yeniden süspanse edin. Hücre karışımını beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polikarbonat tüpe aktarın ve akış sitometrisi yapın.

İkili etiketleme, iyi ve düşük bolus aşılaması arasındaki tümör yükündeki farklılıkların ölçülmesine izin verdi.