För att infektera salmonellakulturer med bakterier späder fager ut en nattkultur av salmonella enterica i en slutlig volym på fem milliliter LB och tillsätt 0,1 milliliter tidigare beredda bakterier, faglysat till den. Inkubera sedan vid 37 grader Celsius och 200 RPM i 24 timmar. I ett 50-milliliters koniskt centrifugrör, späd bakteriekulturen som innehåller fager 100 gånger i fem milliliter 0,22 mikronfiltrerad LB. Centrifugera suspensionen i 10 minuter vid 2 377 g.
Dekantera försiktigt supernatanten och lämna lite volym i botten för att säkerställa närvaron av celler. Tvätta bakteriecellerna med 10 milliliter 0,22 mikronfiltrerat LB-medium. Efter att ha upprepat centrifugeringen och tvättat tre gånger, återsuspendera pelleten i fem milliliter av det filtrerade LB. Använd ett vakuumfiltreringssystem för att filtrera 50 mikroliter av den erhållna bakteriesuspensionen genom ett sterilt 0,45 mikronfilter.
Skölj filtret med 100 milliliter av det filtrerade LB.To underlätta fagfrisättning från bakterieceller, inkubera filtret som innehåller cellerna utan att demontera systemet. Skölj filtret igen, som visats tidigare, med hjälp av vakuumfiltreringssystemet. För att återvinna bakteriecellerna från filtret med steril pincett, överför filtret till en kolv.
Tillsätt sedan två milliliter 2x LB över filtret och pipettera flera gånger för att frigöra cellerna från filtret. Centrifugera en milliliter av denna suspension i två minuter vid 10 354 g. Efter att ha kasserat supernatanten, tvätta cellerna tre gånger med en milliliter filtrerat LB-medium.
Återsuspendera sedan cellerna i en milliliter 2x LB. Blanda sedan kommersiell salmonella enterica lipopolysackarid, eller LPS, med 20 mikroliter av bakteriesuspensionen i en milliliter filtrerad LB. Inkubera blandningen i två timmar vid 37 grader Celsius med skakning vid 200 RPM för att förhindra återinfektion av bakterier. Överför därefter en milliliter kultur till ett mikrocentrifugrör och centrifugera suspensionen i två minuter vid 10, 354 g. Tvätta pelleten tre gånger med en milliliter filtrerat LB-medium.
Efter tvätt, återsuspendera pelleten i en milliliter 2x LB. Tillsätt 20 mikroliter av denna blandning till en milliliter filtrerad LB, som innehåller 0,8 milligram per milliliter kommersiell LPS. Och inkubera blandningen vid 37 grader Celsius och 200 RPM i två timmar. Pelletera sedan en milliliter kultur i ett mikrocentrifugrör genom centrifugering i två minuter vid 10, 354 g.
Efter att ha tvättat cellerna tre gånger med filtrerat LB, återsuspendera dem i en milliliter filtrerad LB. Använd ett vakuumfiltreringssystem, passera en milliliter bakteriesuspension genom ett sterilt 0.45 mikron filter och skölj filtret med 100 milliliter filtrerad LB. Överför filtret till en kolv med en steril pincett. Tillsätt två milliliter 2x LB över filtret och pipettera flera gånger för att frigöra celler från filtret. Centrifugera en milliliter celler i två minuter vid 10, 354g innan du tvättar tre gånger med filtrerad LB. Återsuspendera de uppsamlade cellerna i en milliliter 2x LB.To förbered det fagfria inokulatet, tillsätt 100 mikroliter celler från bakteriesuspensionen till 900 mikroliter LB innehållande 0,45 milligram per milliliter LPS.
Inkubera vid 37 grader Celsius i 24 timmar med skakning vid 200 rpm. Använd detta som alikvot för att bekräfta frånvaron av fagåterinfektion. Genom att utföra titreringar i olika stadier av protokollet observerades att upprepad tvättning och filtrering inte var tillräckligt för att eliminera bakteriefager från kulturer.
Antalet fager minskade dock så snart ett steg av inkubation med kommersiell LPS användes. Det avgörande steget för att fullständigt avlägsna bakteriefager i bakteriekulturen var den andra inkubationen med kommersiell LPS.
