Name: a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

Wij danken de leden van de Evans laboratorium voor hun hulp bij de voorbereiding van deze presentatie. De morpholinos hier gebruikt werden oorspronkelijk gevalideerd door dr. Audrey Holtzinger. TE wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL064282 en HL056182). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Institute for Animal Care en gebruik Comite dat is ingesteld, van het Weill Cornell Medical College.

Ons doel hier is om de functionele redundantie van twee transcriptiefactoren test voor de specificatie van cardiomyocyt voorouders. De factoren worden gecodeerd door de twee verwante genen gata5 en gata6 en we gebruiken de zebravis model van hun relatieve functies 1 te begrijpen. Onze strategie is het blokkeren van gen-functie met behulp van morpholinos 2. We zullen injecteren morpholinos voor de ene of de andere gen in de bevruchte eieren, en vergelijk de embryonale fenotype met ...

<ol>
	<li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors.">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes.">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs.">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li><li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development.">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li></ol>

In het experiment hier beschreven, combineerden we twee morpholinos, die elk alleen al het genereren van een duidelijke reeks van fenotypen, en vond een heel ander fenotype toen ze samen waren co-injectie. Uiteraard moesten we een rechtvaardiging voor het doen van dit experiment in de eerste plaats. We vermoedden dat de twee genen kunnen elkaar compenseren voor een eerdere functie, in dit geval hart-specificatie. Dit komt omdat de genen zijn zeer verwant (en in staat te binden aan dezelfde DNA-sequenties) en worden uitg...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fish breeder tanks and dividers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish nets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>60mg &#x201C;Instant Ocean&#x201D; per liter dH2O</td>
</tr>
<tr>
<td>100mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette needle puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter instruments, Co.</td>
<td>P-97 Flaming/Brown</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3.5" glass capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-203-G/X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Personna</td>
<td>94-120-71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige, Japan</td>
<td>EG-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded microscope eyepiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Premiere</td>
<td>MF-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ward&#x2019;s Natural Science</td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultrapure agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-357Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scale</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>AB54-S/FACT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable weigh dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>2-202-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Conventional microwave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>General Electric</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Erlenmeyer flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>4980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graduated cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-572-6D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Automatic pipette man</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BrandTech</td>
<td>2026333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% ethanol wash solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tarr</td>
<td>801VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2 tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tech Air</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard apparatus</td>
<td>PLI-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micro Instruments</td>
<td> LTD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American National Can</td>
<td>PM-992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gata5 splice site morpholino</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata5 ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata6 Long Isoform ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Pasteur Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Argent Chemical Laboratories</td>
<td>MS-222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methycellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ICN Biomedicals</td>
<td>155495</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-718-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Size 55</td>
</tr>
<tr>
<td>Depression Microslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48339-009</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis

Gene functie tijdens de embryogenese wordt meestal bepaald door het verlies-van-functie experimenten, bijvoorbeeld door middel van gerichte mutagenese (knock-out) in de muis. In de zebravis model, doeltreffende omgekeerde genetische technieken die zijn ontwikkeld met behulp van micro-injectie van gen-specifieke antisense morpholinos. Morpholinos doel een mRNA via specifieke base-pairing en blokkeren genfunctie tijdelijk door het remmen van vertaling of splitsen voor meerdere dagen tijdens de embryogenese (knockdown). Echter, in gewervelde dieren zoals muizen of zebravissen, kunnen sommige genfuncties worden gestoord door deze benaderingen door de aanwezigheid van een ander gen, dat compenseert het verlies. Dit geldt vooral voor gen-families met zus genen die co-uitgedrukt in dezelfde ontwikkelen van weefsels. In de zebravis, kan functionele compensatie worden getest in een relatief high-throughput wijze, door co-injectie van morpholinos die zich richten op knockdown van beide genen tegelijk. Ook met behulp van morpholinos, kan een genetische interactie tussen twee genen worden aangetoond door knockdown van beide genen samen op sub-threshold levels. Kan bijvoorbeeld morpholinos worden getitreerd zodanig dat noch individuele knockdown een fenotype genereert. Als onder deze omstandigheden, co-injectie van beide morpholinos veroorzaakt een fenotype, is een genetische interactie getoond. Hier laten we zien hoe de functionele redundantie show in het kader van twee verwante GATA transcriptiefactoren. GATA factoren zijn essentieel voor de specificatie van cardiale voorlopercellen, maar dit is alleen onthuld door het verlies van zowel Gata5 en Gata6. We laten zien hoe het uitvoeren van micro-injectie experimenten, valideren morpholinos, en evalueren van het gecompenseerde fenotype voor cardiogenese.

Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo&#39;s.

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick

Elevated Plus Maze for Mice

Verhoogd Plus Maze voor muizen

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissectie van de hippocampus dentate gyrus van de volwassen muis

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...