Name: a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

Wir danken Mitglieder der Evans-Labor für ihre Hilfe bei der Vorbereitung dieser Präsentation. Die hier verwendeten Morpholinos wurden ursprünglich von Dr. Audrey Holtzinger validiert. TE wird durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (HL064282 und HL056182) unterstützt. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Institute for Animal Care und Verwenden eingesetzten Ausschusses, des Weill Cornell Medical College durchgeführt.

Unser Ziel ist es, die funktionelle Redundanz von zwei Transkriptionsfaktoren für die Spezifikation von Kardiomyozyten Vorfahren zu testen. Die Faktoren werden von den beiden Genen gata5 und gata6 kodiert, und wir sind mit dem Zebrafisch-Modell, um ihre relative Funktionen 1 zu verstehen. Unsere Strategie ist es Genfunktion mit Morpholinos 2 Block. Wir werden Morpholinos für die eine oder andere Gen in befruchtete Eier zu injizieren, und vergleichen Sie die embryonalen Phänotyp...

<ol>
	<li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors.">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes.">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs.">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li><li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development.">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li></ol>

In dem hier beschriebenen Experiment, kombiniert man zwei Morpholinos, von denen jeder allein erzeugen eine deutliche Reihe von Phänotypen, und fand eine ganz andere Phänotyp, wenn sie co-injiziert zusammen. Natürlich benötigten wir eine Rechtfertigung dafür dieses Experiment in den ersten Platz. Wir vermuteten, dass die beiden Gene könnten sich gegenseitig für eine frühere Funktion zu kompensieren, in diesem Fall kardiale Spezifikation. Dies liegt daran, die Gene sehr verwandt sind (und in der Lage die Bindung ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fish breeder tanks and dividers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish nets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>60mg &#x201C;Instant Ocean&#x201D; per liter dH2O</td>
</tr>
<tr>
<td>100mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette needle puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter instruments, Co.</td>
<td>P-97 Flaming/Brown</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3.5" glass capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-203-G/X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Personna</td>
<td>94-120-71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige, Japan</td>
<td>EG-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded microscope eyepiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Premiere</td>
<td>MF-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ward&#x2019;s Natural Science</td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultrapure agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-357Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scale</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>AB54-S/FACT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable weigh dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>2-202-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Conventional microwave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>General Electric</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Erlenmeyer flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>4980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graduated cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-572-6D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Automatic pipette man</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BrandTech</td>
<td>2026333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% ethanol wash solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tarr</td>
<td>801VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2 tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tech Air</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard apparatus</td>
<td>PLI-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micro Instruments</td>
<td> LTD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American National Can</td>
<td>PM-992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gata5 splice site morpholino</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata5 ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata6 Long Isoform ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Pasteur Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Argent Chemical Laboratories</td>
<td>MS-222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methycellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ICN Biomedicals</td>
<td>155495</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-718-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Size 55</td>
</tr>
<tr>
<td>Depression Microslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48339-009</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis

Gene-Funktion während der Embryogenese wird typischerweise durch loss-of-function Experimente definiert, zum Beispiel durch gezielte Mutagenese (KO) in der Maus. In der Zebrafisch-Modell, über wirksame reverse genetische Techniken entwickelt, mit Mikroinjektion von Gen-spezifischen Antisense Morpholinos. Morpholinos Ziel einer mRNA durch spezifische Basenpaarung und Block Genfunktion vorübergehend durch die Hemmung der Translation oder Spleißen für mehrere Tage während der Embryogenese (Zuschlag). Doch bei Wirbeltieren wie Maus oder Zebrafisch, können einige Funktionen von Genen durch diese Ansätze durch die Anwesenheit eines anderen Gens, das für den Verlust entschädigt verdeckt werden. Dies gilt insbesondere für die Gen-Familien, die Schwester Gene, die in der gleichen entwickelnde Gewebe co-exprimiert. In Zebrafisch können funktionelle Kompensation in einem relativ hohen Durchsatz Weise getestet werden, durch Co-Injektion von Morpholinos dieses Ziel Knockdown von beiden Genen gleichzeitig. Ebenso mit Morpholinos, kann eine genetische Interaktion zwischen zwei Genen, die durch Knockdown beider Gene demonstriert zusammen mit sub-Schwellenwerte. Zum Beispiel kann Morpholinos titriert, so dass weder einzelne Knockdown einen Phänotyp erzeugt werden. Wenn unter diesen Bedingungen, Ursachen Co-Injektion von sowohl Morpholinos einem Phänotyp, ist eine genetische Interaktion gezeigt. Hier zeigen wir, wie man funktionale Redundanz im Rahmen von zwei verwandten GATA-Transkriptionsfaktoren zeigen. GATA Faktoren sind für die Spezifikation von kardialen Vorläuferzellen notwendig, aber dies ist nur durch den Verlust der beiden Gata5 und Gata6 enthüllt. Wir zeigen, wie die Durchführung Mikroinjektion Experimente bestätigen die Morpholinos, und bewerten die ausgeglichen Phänotyp für Kardiogenese.

Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene-Funktion kann in loss-of-function Experimente verdeckt werden, wenn es eine Kompensation durch ein anderes Gen. Der Zebrafisch-Modell bietet eine relativ hohem Durchsatz, um eine solche funktionelle Redundanz in lebenden Embryonen zu offenbaren.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Elevated Plus Maze for Mice

Elevated Plus Maze für Mäuse

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...