Name: a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדה אוונס על עזרתם בהכנת המצגת. Morpholinos השתמשו כאן היו תקפות במקור על ידי ד&quot;ר אודרי Holtzinger. TE נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (HL064282 ו HL056182). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, של וייל קורנל מדיקל קולג&#39;.

המטרה שלנו כאן היא לבחון את יתירות פונקציונלית של שני גורמי שעתוק עבור המפרט של אבות cardiomyocyte. גורמים מקודדים על ידי שני גנים הקשורים gata5 ו gata6 ואנחנו באמצעות מודל דג הזברה כדי להבין פונקציות היחסי 1. האסטרטגיה שלנו היא לחסום לתפקד הגן באמצעות morpholinos 2.<...

<ol>
	<li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors.">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes.">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs.">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li><li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development.">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li></ol>

בניסוי המתואר כאן, אנחנו בשילוב שני morpholinos, שכל אחד מהם לבדו ליצור מגוון של פנוטיפים שונים, ומצא פנוטיפ שונה לגמרי כשהיו שיתוף מוזרק ביחד. כמובן, אנחנו צריכים להצדיק את ביצוע הניסוי הזה מלכתחילה. חשדנו כי שני גנים יכול לפצות אחד את השני עבור פונקציה קודמת, במפרט במקרה ז...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fish breeder tanks and dividers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish nets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>60mg &#x201C;Instant Ocean&#x201D; per liter dH2O</td>
</tr>
<tr>
<td>100mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette needle puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter instruments, Co.</td>
<td>P-97 Flaming/Brown</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3.5" glass capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-203-G/X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Personna</td>
<td>94-120-71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige, Japan</td>
<td>EG-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded microscope eyepiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Premiere</td>
<td>MF-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ward&#x2019;s Natural Science</td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultrapure agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-357Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scale</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>AB54-S/FACT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable weigh dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>2-202-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Conventional microwave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>General Electric</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Erlenmeyer flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>4980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graduated cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-572-6D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Automatic pipette man</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BrandTech</td>
<td>2026333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% ethanol wash solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tarr</td>
<td>801VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2 tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tech Air</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard apparatus</td>
<td>PLI-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micro Instruments</td>
<td> LTD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American National Can</td>
<td>PM-992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gata5 splice site morpholino</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata5 ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata6 Long Isoform ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Pasteur Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Argent Chemical Laboratories</td>
<td>MS-222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methycellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ICN Biomedicals</td>
<td>155495</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-718-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Size 55</td>
</tr>
<tr>
<td>Depression Microslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48339-009</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis

פונקציה ג&#39;ין במהלך embryogenesis מוגדר בדרך כלל על ידי אובדן של פונקציה ניסויים, למשל על ידי mutagenesis ממוקד (נוקאאוט) בתוך העכבר. במודל דג הזברה, יעיל טכניקות גנטיות הפוך פותחו באמצעות microinjection של גן ספציפי morpholinos antisense. Morpholinos יעד mRNA באמצעות זיווג בסיסים ספציפיים גן פונקציה לחסום זמנית על ידי תרגום שחבור עיכוב או במשך מספר ימים במהלך embryogenesis (מציאה). עם זאת, בעלי חוליות כמו עכבר או דג הזברה, פונקציות כמה גנים יכולים להיות מוסתר על ידי גישות אלו בשל נוכחותם של גן אחר אשר מפצה על אובדן. זה נכון במיוחד עבור משפחות גנים המכילים גנים אחותו כי הם שיתוף לידי ביטוי בפיתוח רקמות זהה. בשנת דג הזברה, פיצוי תפקודית ניתן לבדוק באופן יחסית תפוקה גבוהה, על ידי הזרקה משותף של morpholinos כי היעד מציאה של שני גנים בעת ובעונה אחת. כמו כן, באמצעות morpholinos, אינטראקציה גנטית בין כל שני גנים ניתן להדגים על ידי מציאה של גנים שניהם יחד משנה סף רמות. לדוגמה, ניתן morpholinos טיטרציה כזו לא מציאה הפרט יוצר פנוטיפ. אם, בתנאים אלה, שיתוף הזרקה של שני morpholinos גורם פנוטיפ, אינטראקציה גנטית מוצג. כאן אנו מדגימים כיצד להראות יתירות פונקציונלית בהקשר של שני גורמי תעתוק הקשורות גאטה. גורמים gata חיוניים מפרט של אבות לב, אבל זה מתגלה רק על ידי אובדן של שני Gata5 ו Gata6. אנו מראים כיצד לבצע ניסויים microinjection, לאמת את morpholinos, ולהעריך את הפנוטיפ פיצוי cardiogenesis.

Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

פונקציה ג&#39;ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Light/dark Transition Test for Mice

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Elevated Plus Maze for Mice

מבוך פלוס גבוהות עבור עכברים

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...