Verkrijg om te beginnen 250 milligram SAT boven de grote borstspier tijdens CIED-implantatie in magnetisch geactiveerde celsorteerweefselopslagoplossing. Bereid één milligram per milliliter Collagenase/Dispase in 10 milliliter koude Hanks'Balanced Salt Solution. Hak onder een laminaire stroomkast weefsels in stukjes van één kubieke millimeter in 500 microliter collagenase/dispase-oplossing.
Voeg 4,5 milliliter van de collagenase/dispase-oplossing toe aan het mengsel en breng het getritureerde weefsel over in een schone centrifugebuis van 50 milliliter. Was het deksel van de petrischaal met vijf milliliter collagenase/dispase-oplossing en voeg deze toe aan de tube. Incubeer de buis gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een buisrotator die is ingesteld op 20 omwentelingen per minuut.
Om de vertering te stoppen, giet je 10 milliliter volledige endotheelcelgroeimedia in de buis. Na het tritureren van het verteerde mengsel met een 14-gauge Venflon-canule, zeef het door een celzeef van 70 micrometer en spoel het af met 10 milliliter 0.5%PBS-BSA-buffer. Centrifugeer het filtraat bij 300G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
Om de dode cellen te verwijderen, voegt u 200 microliter dode celverwijderingsparels toe aan de celpellet die in een microcentrifugebuis is genomen en incubeert. Bevestig vervolgens een vloeistofscheidingskolom met een filter van 30 micrometer aan de separatormagneet en plaats er een centrifugebuis van 15 milliliter onder. Na het wassen van de kolom met de bindingsbuffer voor het verwijderen van dode cellen, voegt u de monsterparelsuspensie toe.
Laat het onder de zwaartekracht passeren en vang het eluaat op. Draai vervolgens de verzamelde levende cel eluaat en resuspendeer de resulterende pellet in 400 microliter 0,5%PBS-BSA. Incubeer de gesuspendeerde cellen met 20 microliter anti-CD31-gecoate magnetische kralen bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.
Resuspendeer de celpellet na het centrifugeren in 500 microliter 0,5%PBS-BSA. Bevestig een kolom met een filter van 30 micrometer aan de separatormagneet en plaats er een centrifugebuis van 15 milliliter onder. Voeg de celmicrobead-suspensie toe aan de kolom en laat deze onder zwaartekracht passeren.
Plaats de kolom na het wassen in een verse centrifugebuis van 15 milliliter en voeg een milliliter 0,5%PBS-BSA toe aan de kolom. Druk op de kolomzuiger om de CD31-positieve fractie op te vangen. Centrifugeer het monster zoals eerder aangetoond en resuspendeer de celpellet in één milliliter volledig microvasculaire endotheelcelgroeimedia.
Doseer de suspensie in twee putjes van een 2%-gelatine-gecoate plaat met 24 putjes. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende twee tot vier weken totdat de cellen bijna 80% samenvloeien.
