Pour commencer, obtenez 250 milligrammes de SAT au-dessus du muscle principal pectoral lors de l’implantation du CIED dans une solution de stockage de tissus de tri cellulaire activée magnétiquement. Préparez un milligramme par millilitre de collagénase/dispase dans 10 millilitres de solution saline équilibrée froide de Hanks. Sous une armoire à flux laminaire, hachez les mouchoirs en morceaux d’un millimètre cube dans 500 microlitres de solution de collagénase/dispase.
Ajoutez 4,5 millilitres de la solution de collagénase/dispase au mélange et transférez le tissu trituré dans un tube à centrifuger propre de 50 millilitres. Lavez le couvercle de la boîte de Pétri avec cinq millilitres de solution de collagénase/dispase et ajoutez-le dans le tube. Incuber le tube pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un rotateur de tube réglé à 20 tours par minute.
Pour arrêter la digestion, versez 10 millilitres de milieu de croissance complet des cellules endothéliales dans le tube. Après avoir trituré le mélange digéré à l’aide d’une canule Venflon de calibre 14, passez-le à travers un tamis à cellules de 70 micromètres et rincez-le avec 10 millilitres de tampon PBS-BSA à 0,5 %. Centrifugez le filtrat à 300G pendant 10 minutes à température ambiante et jetez le surnageant.
Pour éliminer les cellules mortes, ajoutez 200 microlitres de billes d’élimination des cellules mortes à la pastille de cellule prélevée dans un tube de microcentrifugation et incuber. Fixez ensuite une colonne de séparation de liquide avec un filtre de 30 micromètres à l’aimant séparateur et placez un tube de centrifugation de 15 millilitres en dessous. Après avoir lavé la colonne avec un tampon d’élimination des cellules mortes, ajoutez la suspension de billes d’échantillon.
Laissez-le passer sous gravité et récupérez l’éluat. Ensuite, faites tourner l’éluat de cellules vivantes collecté et remettez en suspension la pastille résultante dans 400 microlitres de PBS-BSA à 0,5 %. Incuber les cellules suspendues avec 20 microlitres de billes magnétiques recouvertes d’un anti-CD31 à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Après centrifugation, remettre en suspension la pastille de cellule dans 500 microlitres de 0,5% PBS-BSA. Fixez une colonne avec un filtre de 30 micromètres à l’aimant séparateur et placez un tube à centrifuger de 15 millilitres en dessous. Ajoutez la suspension de microbilles de cellule à la colonne et laissez-la passer sous l’effet de la gravité.
Après avoir lavé la colonne, placez-la dans un tube à centrifuger frais de 15 millilitres et ajoutez un millilitre de PBS-BSA à 0,5 % dans la colonne. Poussez le piston de la colonne pour recueillir la fraction CD31 positive. Centrifugez l’échantillon comme démontré précédemment et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de croissance complet des cellules endothéliales microvasculaires.
Distribuer la suspension dans deux puits d’une plaque à 24 puits recouverte de gélatine à 2 %. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à quatre semaines jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes à près de 80 %.
