Till att börja med, erhåll 250 milligram SAT ovanför bröstmusklernas huvudmuskel under CIED-implantation i magnetaktiverad cellsorterande vävnadslagringslösning. Förbered ett milligram per milliliter kollagenas/dispase i 10 milliliter kall Hanks'Balanced Salt Solution. Under ett skåp med laminärt flöde, mal vävnader i bitar på en kubikmillimeter i 500 mikroliter kollagenas/Dispase-lösning.
Tillsätt 4,5 ml av kollagenas-/dispaslösningen till blandningen och överför den triturerade vävnaden till ett rent 50-milliliters centrifugrör. Tvätta petriskålens lock med fem milliliter kollagenas/Dispase-lösning och lägg det i tuben. Inkubera röret i 30 minuter vid 37 grader Celsius i en rörrotator inställd på 20 varv per minut.
För att stoppa matsmältningen, häll 10 milliliter komplett endotelcellsodlingsmedia i röret. Efter att ha triturerat den smälta blandningen med en 14-gauge venflonkanyl, sila den genom en 70 mikrometer cellsikt och skölj den med 10 milliliter 0,5 % PBS-BSA-buffert. Centrifugera filtratet vid 300 G i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
För att ta bort de döda cellerna, tillsätt 200 mikroliter pärlor för borttagning av döda celler till cellpelleten som tas i ett mikrocentrifugrör och inkubera. Fäst sedan en vätskeseparationskolonn med ett 30-mikrometerfilter på separatormagneten och placera ett 15-milliliters centrifugrör under. Efter att ha tvättat kolonnen med en bindemedel för borttagning av döda celler, tillsätt provpärlsuspensionen.
Låt den passera under gravitationen och samla upp eluatet. Snurra sedan den insamlade levande celleluaten och återsuspendera den resulterande pelleten i 400 mikroliter 0,5%PBS-BSA. Inkubera de suspenderade cellerna med 20 mikroliter anti-CD31-belagda magnetiska pärlor vid fyra grader Celsius i 20 minuter.
Efter centrifugering, återsuspendera cellpelleten i 500 mikroliter 0,5%PBS-BSA. Fäst en pelare med ett 30-mikrometerfilter på separatormagneten och placera ett 15-milliliters centrifugrör under. Tillsätt cellmikropärlesuspensionen till kolonnen och låt den passera under gravitationen.
Efter att ha tvättat kolonnen, placera den i ett nytt 15-milliliters centrifugrör och tillsätt en milliliter 0,5%PBS-BSA till kolonnen. Tryck på kolonnkolven för att samla upp den CD31-positiva fraktionen. Centrifugera provet som visats tidigare och återsuspendera cellpelleten i en milliliter komplett mikrovaskulärt endotelcellstillväxtmedium.
Fördela suspensionen i två brunnar på en 2% gelatinbelagd 24-håls platta. Odla cellerna vid 37 grader Celsius med 5 % koldioxid i två till fyra veckor tills cellerna blir nästan 80 % sammanflytande.
