Başlamak için, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama doku depolama çözeltisinde CIED implantasyonu sırasında pektoral ana kasının üzerinde 250 miligram SAT elde edin. 10 mililitre soğuk Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisinde mililitre Kollajenaz / Dispase başına bir miligram hazırlayın. Laminer bir akış kabini altında, dokuları 500 mikrolitre Kollajenaz / Dispas çözeltisinde bir milimetreküp parçalar halinde doğrayın.
Karışıma 4,5 mililitre Kollajenaz / Dispas çözeltisi ekleyin ve ezilmiş dokuyu temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Petri kabının kapağını beş mililitre Kollajenaz / Dispas solüsyonu ile yıkayın ve tüpe ekleyin. Tüpü, dakikada 20 devire ayarlanmış bir tüp döndürücüde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Sindirimi durdurmak için, 10 mililitre tam endotel hücre büyüme ortamını tüpe dökün. Sindirilmiş karışımı 14 gauge Venflon kanül ile ezdikten sonra, 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve 10 mililitre %0,5 PBS-BSA tamponu ile durulayın. Süzüntüyü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Ölü hücreleri çıkarmak için, bir mikrosantrifüj tüpünde alınan hücre peletine 200 mikrolitre ölü hücre çıkarma boncuğu ekleyin ve inkübe edin. Ardından, ayırıcı mıknatısa 30 mikrometre filtreli bir sıvı ayırma sütunu takın ve altına 15 mililitrelik bir santrifüj tüpü yerleştirin. Kolonu ölü hücre giderme bağlayıcı tamponu ile yıkadıktan sonra, numune boncuk süspansiyonunu ekleyin.
Yerçekimi altından geçmesine izin verin ve elüatı toplayın. Daha sonra, toplanan canlı hücre elüatını döndürün ve elde edilen peleti 400 mikrolitre% 0.5 PBS-BSA içinde yeniden süspanse edin. Askıya alınmış hücreleri 20 mikrolitre anti-CD31 kaplı manyetik boncuklarla dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.
Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 500 mikrolitre% 0.5 PBS-BSA içinde yeniden süspanse edin. Ayırıcı mıknatısa 30 mikrometre filtreli bir sütun takın ve altına 15 mililitrelik bir santrifüj tüpü yerleştirin. Hücre mikroboncuk süspansiyonunu sütuna ekleyin ve yerçekimi altında geçmesine izin verin.
Kolonu yıkadıktan sonra, 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve kolona bir mililitre% 0.5 PBS-BSA ekleyin. CD31-pozitif fraksiyonu toplamak için kolon pistonunu itin. Numuneyi daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin ve hücre peletini bir mililitre tam mikrovasküler endotel hücre büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu% 2 jelatin kaplı 24 oyuklu bir plakanın iki kuyusuna dağıtın. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile, hücreler yaklaşık% 80 birleşim haline gelene kadar iki ila dört hafta boyunca kültürleyin.
