Para obtener una suspensión de una sola célula del cerebro de la neurona aislada, coloque el cerebro en un homogeneizador Dounce de vidrio preenfriado de 15 mililitros que contenga una cantidad adecuada de solución salina equilibrada de Hanks helada o tampón HBSS. Use el mortero Dounce suelto para disociar suave y lentamente el tejido cerebral con alrededor de 100 a 120 golpes en hielo. Filtre la suspensión de tejido cerebral resultante a través de un filtro de células de 70 micras en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Enjuague el tubo Dounce con cinco mililitros de HBSS y proceda con la filtración para maximizar la recolección de células. Centrifugar la suspensión de tejido filtrado a 550 g durante seis minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante con un aspirador de vacío y vuelva a suspender el paladar celular en un mililitro de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%.
Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Agregue una cantidad adecuada de solución de gradiente de densidad al 30% e invierta suavemente el tubo para asegurar una mezcla completa. Centrifugar inmediatamente el tubo a 845 g con la aceleración y el freno ajustados al nivel tres durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.
Una vez hecho esto, retire suavemente el tubo de la centrífuga sin agitar y aspire con cuidado la capa superior de mielina con una punta de un mililitro conectada a la aspiradora. A continuación, aspire el sobrenadante, dejando uno o dos mililitros, y vuelva a suspender el paladar celular con un mínimo de 10 mililitros de HBSS frío. Centrifugar a 550 g durante seis minutos a cuatro grados centígrados.
Lavar una vez más con un mínimo de siete mililitros de HBSS frío y volver a centrifugar. Después de eliminar la mayor cantidad posible del sobrenadante, vuelva a suspender las células en 100 a 200 microlitros de tampón de citometría de flujo para el análisis de citometría de flujo.
