在 48 孔板中扩增克罗恩病患者来源的结肠样细胞后，轻轻地从孔边缘去除培养基，而不会损坏结肠样圆顶。向每个孔中加入 300 微升补充有 10 微摩尔 ROC1 和两种抑制剂 Y-27632 的酶解离试剂。使用 P1000 移液器吸头，刮擦孔表面以打破结肠状圆顶，并上下移液细胞悬液。
将细胞悬液转移到 15 mL 试管中。将收集的结肠素在 37 摄氏度的水浴中孵育 5 分钟。将结肠素以 400 x g 离心 3 分钟，然后去除上清液，在试管中留下约 1.2 mL。
接下来，将 P1000 移液器的尖端放入悬浮液中，将其保持在试管底部的正上方，然后快速将悬浮液移入和移出尖端以解离结肠素。在显微镜下观察试管，以确保没有完整的结肠样体残留。结肠样片段的大小约为 30 至 40 微米。
接下来，将 10 毫升冰冷的类器官洗涤介质添加到 15 毫升试管中。将试管以 400 x g 离心 3 分钟。去除上清液，将沉淀重悬于一毫升冰冷的类器官洗涤培养基中。
将悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中，并将其标记为结肠样碎片管。混合后，将 50 μL 样品转移到新试管中，并将其标记为细胞计数管。将试管以 400 x g 离心 3 分钟。
去除上清液，将沉淀重悬于 500 微升酶解离试剂中，补充有 10 微摩尔 Y-27632。将单细胞计数管在 37 摄氏度的水浴中孵育 5 分钟。使用设置为 400 μL 的 P1000 移液器，快速移液样品。
然后在显微镜下观察样品，以确保单细胞悬液。将 1 毫升类器官洗涤培养基添加到单细胞计数管中。然后离心悬浮液并去除上清液，然后将沉淀重悬于 50 μL 类器官洗涤培养基中。
加入 50 微升台盼蓝，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。基于此，计算结肠样片段管中细胞的浓度。在新的 1.5 ml 微量离心管中离心所需体积。
然后去除上清液。将沉淀重悬于基底膜提取物或 BME 中。现在在预孵育的 96 孔微量滴定板中，每孔反向移液 10 微升结肠样 BME 溶液，并定期小心混合溶液以防止接种不均匀。
倒置板并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。20 分钟后，用 200 微升预热的类器官增殖培养基覆盖圆顶，并继续孵育 3 天。
