Efter att ha expanderat kolonoider som härrör från patienter vid Crohns sjukdom i en platta med 48 brunnar, ta försiktigt bort mediet från brunnens kant utan att skada kolonoidkupolen. Tillsätt 300 mikroliter enzymatiskt dissociationsreagens kompletterat med 10 mikromolar ROC1 och två hämmare Y-27632 till varje brunn. Använd en P1000-pipettspets för att skrapa ytan på brunnen för att bryta kolonoidkupolen och pipettera cellsuspensionen upp och ner.
Överför cellsuspensionen till ett 15 ml-rör. Inkubera de insamlade kolonoiderna i ett 37 grader varmt vattenbad i fem minuter. Centrifugera kolonoiderna vid 400 x g i tre minuter och ta bort supernatanten, lämna cirka 1,2 milliliter i röret.
Placera sedan spetsen på P1000-pipetten i suspensionen, håll den precis ovanför botten av röret och pipettera snabbt suspensionen in och ut ur spetsen för att dissociera kolonoiderna. Observera röret under mikroskopet för att säkerställa att inga hela kolonoider finns kvar. Och kolonoidfragment är ungefär 30 till 40 mikrometer stora.
Tillsätt sedan 10 milliliter iskallt organoidtvättmedel till 15 milliliters röret. Centrifugera röret vid 400 x g i tre minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i en milliliter iskallt organoidtvättmedel.
Överför suspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och märk det som ett kolonoidfragmentrör. Efter blandning, överför 50 mikroliter av provet till ett nytt rör och märk det som ett cellräkningsrör. Centrifugera röret vid 400 x g i tre minuter.
Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 mikroliter enzymatiskt dissociationsreagens, kompletterat med 10 mikromolar Y-27632. Inkubera röret för enkelcelltal i ett vattenbad med 37 grader Celsius i fem minuter. Använd en P1000-pipett inställd på 400 mikroliter för att snabbt pipettera provet.
Observera sedan provet under ett mikroskop för att säkerställa en encellssuspension. Tillsätt en milliliter organoidtvättmedel till röret för enkelcellräkning. Centrifugera sedan suspensionen och avlägsna supernatanten innan du åter suspenderar pelleten i 50 mikroliter organoid tvättmedia.
Tillsätt 50 mikroliter trypanblått och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Baserat på detta, beräkna koncentrationen av celler i kolonoidfragmentröret. Centrifugera den erforderliga volymen i ett nytt 1.5 milliliter mikrocentrifugrör.
Ta sedan bort supernatanten. Återsuspendera pelleten i basalmembranextrakt, eller BME. I en förinkuberad 96-håls mikrotiterplatta, vänd nu 10 mikroliter av kolonoid BME-lösningen per brunn och blanda försiktigt lösningen regelbundet för att förhindra ojämn sådd.
Vänd upp och ner på plattan och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter 20 minuter, överlägg kupolerna med 200 mikroliter förvärmda organoidproliferationsmedier och fortsätt inkubationen i tre dagar.
