Na het incuberen van colonoïden van de ziekte van Crohn gedurende drie dagen, kantelt u de plaat en verwijdert u het medium van de rand van de putjes. Voeg 200 microliter per putje cytokinebehandelingsmedia toe die 2,5 micromolaire fluorescerende celdoodkleurstof bevatten. Incubeer de colonoïden bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende de vereiste behandelingstijd.
Breng de plaat na incubatie over naar de tafel van een digitale omgekeerde epifluorescentiemicroscoop en bevestig dat de maximale toxiciteitstoestand colonoïden volledig zijn gelyseerd. Gebruik het transmissiekanaal om je te concentreren op een colonoïde met SYTOX-positieve cellen. Schakel vervolgens over naar het GFP-kanaal.
Pas de lichtintensiteit en belichtingstijd aan om het fluorescerende signaal te maximaliseren en de achtergrond te minimaliseren. Gebruik geoptimaliseerde beeldinstellingen om de omstandigheden zonder kleurstof en maximale toxiciteit in acht te nemen om ervoor te zorgen dat de monsters niet over- of onderbelicht zijn. Verkrijg transmissie- en GFP-beelden van colonoïden met behulp van een willekeurige steekproefbenadering door gezichtsvelden te selecteren die een vast rasterpatroon volgen dat de colonoïde koepel bedekt.
Sla afbeeldingen op in een draagbaar grafisch netwerkformaat en exporteer ze. Sleep de bestanden van de afbeeldingsdataset naar de ImageJ-werkbalk en klik achtereenvolgens op Afbeelding, Stapels en Afbeeldingen om te stapelen om de bestanden te combineren. Klik vervolgens op Afbeelding gevolgd door Type en 8-bits om de afbeeldingsstapel naar een 8-bits bestand te converteren.
Klik op de tool Selecties uit de vrije hand en selecteer handmatig het interessegebied op het transmissiebeeld. Schakel vervolgens door de afbeeldingsstapel naar de bijbehorende GFP-kanaalafbeelding. Klik op de werkbalk op Analyseren en metingen instellen.
Vink in het dialoogvenster Afmetingen instellen de gemiddelde grijswaarde aan en laat andere vakjes uitgeschakeld. Selecteer de GFP-afbeelding en klik op Analyseren en meten. Zodra de gegevensset is geanalyseerd, kopieert u alle gegevens in het resultatenvenster en plakt u ze in een spreadsheet.
Bereken het gemiddelde van de technische gemiddelde grijswaarden voor elke voorwaarde. Trek het gemiddelde van de onbehandelde aandoening af van elke behandelingsaandoening. Deel vervolgens elke behandelingsconditie door het achtergrond-afgetrokken gemiddelde van de maximale toxiciteitsconditie.
Om de levensvatbaarheid van de cellen na de behandeling te berekenen, trekt u de genormaliseerde waarden af van één. Bereken met behulp van de gegeven vergelijking de coëfficiënt van de perturbagen-interactie. Transmissie fluorescerende overlay-beelden van colonoïden na acht uur gaven aan dat alleen de met interferon-gamma plus TNF-alfa behandelde colonoïden positief waren voor het fluorescerende signaal.
Na 24 uur vertoonden colonoïden behandeld met interferon-gamma plus TNF-alfa grote gebieden die positief waren voor fluorescerend signaal met een duidelijke uitsplitsing in de colonoïde morfologie. De celdoodniveaus na acht uur waren laag voor BSA-controlecolonoïden met een lichte toename van met TNF-alfa behandelde aandoeningen. Na 24 uur vertoonden met interferon gamma plus TNF-alfa behandelde colonoïden de hoogste celdoodniveaus.
CPI-waarden duidden op een lichte synergisme na acht uur en een substantiële synergisme na 24 uur. Dit bevestigde een tijdsafhankelijke synergetische interactie tussen interferon-gamma en TNF-alfa.
