Efter att ha inkuberat kolonoider från patienter med Crohns sjukdom i tre dagar, luta plattan och ta bort mediet från brunnarnas kant. Tillsätt 200 mikroliter cytokinbehandlingsmedia som innehåller 2,5 mikromolara fluorescerande celldödsfärgämne. Inkubera kolonoiderna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid under den nödvändiga behandlingstiden.
Efter inkubation, överför plattan till stadiet av ett digitalinverterat epifluorescensmikroskop och bekräfta att det maximala toxicitetstillståndet kolonoider är fullständigt lyserade. Använd transmissionskanalen för att fokusera på en kolon med SYTOX-positiva celler. Växla sedan till GFP-kanalen.
Justera ljusintensiteten och exponeringstiden för att maximera den fluorescerande signalen samtidigt som bakgrunden minimeras. Använd optimerade bildinställningar, observera villkoren för inget färgämne och maximal toxicitet för att säkerställa att proverna inte är över- eller underexponerade. Samla in transmissions- och GFP-bilder av kolonoider med hjälp av en slumpmässig provtagningsmetod genom att välja synfält som följer ett fast rutnätsmönster som täcker kolonoidkupolen.
Spara bilder i bärbart nätverksgrafiskt format och exportera dem. Dra och släpp bilddatauppsättningsfilerna i verktygsfältet ImageJ och klicka sekventiellt på Bild, Staplar och Bilder att stapla för att kombinera filerna. Klicka sedan på Bild följt av Typ och 8-bitars för att konvertera bildstapeln till en 8-bitarsfil.
Klicka på verktyget Frihandsmarkeringar och välj manuellt det intressanta området på överföringsbilden. Växla sedan genom bildstapeln till motsvarande GFP-kanalbild. I verktygsfältet klickar du på Analysera och ställ in mått.
I dialogrutan Ställ in mått markerar du Medelvärde för grått och lämnar andra rutor omarkerade. När du har markerat GFP-bilden klickar du på Analysera och mät. När datauppsättningen har analyserats kopierar du alla data i resultatfönstret och klistrar in dem i ett kalkylblad.
Beräkna medelvärdet av de tekniska replikerade medelvärdena för grått för varje villkor. Subtrahera medelvärdet av det obehandlade tillståndet från varje behandlingstillstånd. Dividera sedan varje behandlingstillstånd med det bakgrundssubtraherade medelvärdet av det maximala toxicitetstillståndet.
För att beräkna cellviabilitet efter behandling, subtrahera de normaliserade värdena från ett. Med hjälp av den givna ekvationen beräkna koefficienten för stör interaktionen. Transmissionsfluorescerande överlagringsbilder av kolonoider efter åtta timmar indikerade att endast interferon gamma plus TNF alfa-behandlade koloider var positiva för fluorescerande signal.
Efter 24 timmar uppvisade kolonoider som behandlades med interferon gamma plus TNF alfa stora områden som var positiva för fluorescerande signal med en tydlig nedbrytning av kolonoidmorfologin. Celldödsnivåerna vid åtta timmar var låga för BSA-kontrollkolonoider med en liten ökning av TNF alfa-behandlade tillstånd. Efter 24 timmar uppvisade interferon gamma plus TNF alfa-behandlade koloider de högsta celldödsnivåerna.
KPI-värden indikerade liten synergi vid åtta timmar och betydande synergi vid 24 timmar. Detta bekräftade en tidsberoende synergistisk interaktion mellan interferon gamma och TNF alfa.
