먼저, 균질화된 돼지 뇌 조직의 정제된 추출물을 섭취하십시오. 전 식힌 ultrarifugation 관으로 추출물을 따르고, 75, 4개 섭씨 온도에 60 분 동안 000G에 분리기. 상층액을 수집하고 부피 S1을 측정합니다. 다음으로, 상층액에 MEM 완충액을 10배 첨가하고 잘 섞는다.
글리세롤과 GTP를 각각 3.5몰과 0.1밀리몰의 최종 농도에 첨가합니다. 현탁액을 초원심분리 튜브에 붓고 섭씨 37도에서 수조에서 45분 동안 배양합니다. 그 후에, 75에 관을 분리하십시오, 섭씨 37 온도에 90 분 동안 000G.
그런 다음 버리기 전에 상층액 S2의 부피를 측정하십시오. 이제 펠릿에 동일한 양의 얼음처럼 차가운 MEM 버퍼를 추가합니다. 펠릿을 재현탁한 후 현탁액을 눈금이 매겨진 실린더로 옮기고 총 부피를 결정합니다.
그런 다음 GTP를 최종 농도 1mmaular에 첨가합니다. 현탁액을 다운스 글라스 균질화기로 옮기고 얼음 위에서 45분 동안 10분마다 간헐적으로 용액을 균질화합니다. 균질화된 용액을 사전 냉각된 초원심분리 튜브에 붓습니다.
75, 000G에서 섭씨 4도에서 60분 동안 원심분리하고 상층액 S3의 부피를 결정합니다. 이제 상층액을 글리세롤과 혼합합니다. GTP를 첨가한 후 상층액을 초원심분리 튜브에 붓고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 중합된 상층액이 원심분리되면 상층액 S4의 부피를 확인합니다. 그런 다음 준비된 파이프 버퍼를 펠릿이 있는 튜브에 고르게 나누고 펠릿을 숟가락으로 재현탁합니다.
펠릿을 균질화하기 후에, 75에 현탁액을 분리하십시오, 4개의 섭씨 온도에 60 분 동안 000G. 상층액 S5의 부피를 측정하고 계산된 dimethyl sulfoxide의 부피를 추가합니다. 현탁액을 초원심분리 튜브에 붓고 중합을 허용하기 위해 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
그런 다음 중합된 튜불린을 75, 000G에서 섭씨 30도에서 60분 동안 원심분리합니다. 상층액 S6의 부피를 측정하고 펠릿을 따로 보관하십시오. 펠릿을 PEM 완충액에 용해시킵니다.
Dounce 유리 균질화기를 사용하여 펠릿을 균질화하고 완전히 용해될 때까지 PEM 완충액을 추가합니다.
