Till att börja med tar du det klargjorda extraktet av den homogeniserade hjärnvävnaden från svin. Häll extraktet i förkylda ultracentrifugeringsrör och centrifugera vid 75 000 G i 60 minuter vid fyra grader Celsius. Samla in supernatanten och mät dess volym S1. Tillsätt sedan 10 gånger MEM-bufferten till supernatanten och blanda ordentligt.
Tillsätt glycerol och GTP till en slutlig koncentration på 3,5 molar respektive 0,1 millimolar. Häll suspensionen i ultracentrifugeringsrör och inkubera i 45 minuter vid 37 grader Celsius i ett vattenbad. Centrifugera sedan rören vid 75 000 G i 90 minuter vid 37 grader Celsius.
Mät sedan volymen av supernatanten, S2, innan du kasserar den. Tillsätt nu en lika stor mängd iskall MEM-buffert till pelletsen. Efter att ha återsuspenderat pelletsen, överför suspensionerna till en graderad cylinder och bestäm den totala volymen.
Tillsätt sedan GTP till en slutlig koncentration av en millimolar. Överför suspensionen till en homogenisator av Downs-glas och homogenisera lösningen intermittent var 10:e minut i 45 minuter på is. Häll den homogeniserade lösningen i förkylda ultracentrifugeringsrör.
Centrifugera vid 75 000 G i 60 minuter vid fyra grader Celsius och bestäm volymen av supernatanten, S3. Blanda nu supernatanten med glycerol. Efter tillsats av GTP, häll supernatanten i ultracentrifugeringsrör och inkubera i 45 minuter vid 37 grader Celsius. När den polymeriserade supernatanten har centrifugerats, kontrollera volymen av supernatanten, S4. Dela sedan upp den förberedda rörbufferten jämnt i rör med pellets och suspendera pelletsen igen med en sked.
Efter homogenisering av pelletsen, centrifugera suspensionen vid 75 000 G i 60 minuter vid fyra grader Celsius. Mät volymen av supernatanten, S5, och tillsätt den beräknade volymen dimetylsulfoxid. Häll suspensionen i ultracentrifugeringsrör och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius för att möjliggöra polymerisation.
Centrifugera sedan det polymeriserade tubulinet vid 75 000 G i 60 minuter vid 30 grader Celsius. Mät volymen av supernatanten, S6, och håll pelletsen åt sidan. Lös upp pelletsen i PEM-bufferten.
Homogenisera pelletsen med en Dounce glashomogenisator, samtidigt som du tillsätter PEM-buffert tills den är helt upplöst.
