For å begynne, vend forsiktig 10 milliliter fullblodrør 10 ganger ved romtemperatur. Bruk en svingende bøtterotor til å sentrifugere rørene ved 800 g i 10 minutter ved 22 grader Celsius med bremsen på. Plasser deretter prøvene i et biologisk sikkerhetsskap og se etter de tre forskjellige lagene.
Merk tre fem-milliliters polystyrenrør med bokstavene A, B og C.Virvl og samle en milliliter av buffy coat ved aspirasjon og overfør til røret merket som A.Tilsett deretter 60 mikroliter 0.1 molar EDTA til rør A som inneholder buffy coat. Tilsett 50 mikroliter av cocktailblandingen i rør A.Pipetter opp og ned minst tre ganger for å blande den og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Tilsett deretter 890 mikroliter PBS til rør A og bland ved pipettering minst tre ganger.
Deretter virvler du det magnetiske perlerøret i 30 sekunder. Tilsett 50 mikroliter av de magnetiske perlene i rør A og pipetter minst tre ganger for å blande perlene grundig. Plasser rør A umiddelbart i magnetstativet og inkuber i fem minutter ved romtemperatur.
Pipetterer deretter forsiktig den anrikede cellesuspensjonen i rør B, og samle den klare fraksjonen med ingen eller minimale røde blodlegemer for optimal PBMC-gjenoppretting. Fjern deretter rør A fra magnetstativet og kast det. Tilsett deretter 50 mikroliter magnetiske perler til cellesuspensjon i rør B og pipetter opp og ned minst tre ganger.
Plasser rør B umiddelbart i magnetstativet og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Pipettere forsiktig den anrikede cellesuspensjonen i rør C, og samle bare opp den klare fraksjonen. Fjern rør B fra magnetstativet og kast det.
Plasser deretter rør C umiddelbart i magnetstativet og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Pipetterer forsiktig den anrikede cellesuspensjonen i et merket sentrifugerør og fyll opp til to milliliter med PBS. Overfør 50 mikroliter av cellesuspensjonen til en prøvekopp i den automatiserte celletelleren.
Tilsett 450 mikroliter PBS for et antall fortynningsceller på 1 til 10.
