Para comenzar, invierta suavemente los tubos de sangre entera de 10 mililitros 10 veces a temperatura ambiente. Con un rotor de cangilón oscilante, centrifugar los tubos a 800 g durante 10 minutos a 22 grados centígrados con el freno puesto. A continuación, coloque las muestras en una cabina de seguridad biológica y compruebe si hay tres capas distintas.
Etiquete tres tubos de poliestireno de cinco mililitros con las letras A, B y C. Remolino y recoja un mililitro de la capa leucitaria por aspiración y transfiéralo al tubo etiquetado como A. Luego agregue 60 microlitros de EDTA 0.1 molar al tubo A que contiene la capa leucocitaria. Agregue 50 microlitros de la mezcla de cóctel al tubo A. Pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces para mezclarlo e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de eso, agregue 890 microlitros de PBS al tubo A y mezcle pipeteando al menos tres veces.
A continuación, agite el tubo de cuentas magnéticas durante 30 segundos. Agregue 50 microlitros de las perlas magnéticas al tubo A y pipetee al menos tres veces para mezclar bien las perlas. Coloque inmediatamente el tubo A en el soporte magnético e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, pipetee cuidadosamente la suspensión celular enriquecida en el tubo B, recogiendo la fracción clara con glóbulos rojos mínimos o sin glóbulos rojos para una recuperación óptima de PBMC. Después de eso, retire el tubo A del soporte magnético y deséchelo. A continuación, agregue 50 microlitros de perlas magnéticas a la suspensión celular en el tubo B y pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces.
Coloque inmediatamente el tubo B en el soporte magnético e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pipetear con cuidado la suspensión celular enriquecida en el tubo C, recogiendo solo la fracción clara. Retire el tubo B del soporte magnético y deséchelo.
A continuación, coloque inmediatamente el tubo C en el soporte magnético e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pipetee cuidadosamente la suspensión celular enriquecida en un tubo de centrífuga marcado y rellene hasta dos mililitros con PBS. Transfiera 50 microlitros de la suspensión celular a un vaso de muestra del contador de células automatizado.
Agregue 450 microlitros de PBS para un recuento de células de dilución de 1 a 10.
