Börja med att försiktigt invertera 10 milliliter helblodrör 10 gånger i rumstemperatur. Använd en svängande skoprotor och centrifugera rören vid 800 g i 10 minuter vid 22 grader Celsius med bromsen på. Placera sedan proverna i ett biologiskt säkerhetsskåp och kontrollera de tre distinkta skikten.
Märk tre fem milliliter polystyrenrör med bokstäverna A, B och C.Swirl och samla upp en milliliter av buffybeläggningen genom aspiration och överför till röret märkt som A.Tillsätt sedan 60 mikroliter 0,1 molar EDTA till rör A som innehåller buffypälsen. Tillsätt 50 mikroliter av cocktailblandningen i rören A.Pipette upp och ner minst tre gånger för att blanda den och inkubera den i fem minuter i rumstemperatur. Tillsätt sedan 890 mikroliter PBS till rör A och blanda genom pipettering minst tre gånger.
Virvla sedan det magnetiska pärlröret i 30 sekunder. Tillsätt 50 mikroliter av de magnetiska pärlorna i rör A och pipettera minst tre gånger för att blanda pärlorna ordentligt. Placera omedelbart rör A i magnetstativet och inkubera i fem minuter i rumstemperatur.
Pipettera sedan försiktigt den berikade cellsuspensionen i rör B och samla upp den klara fraktionen med inga eller minimala röda blodkroppar för optimal PBMC-återhämtning. Ta sedan bort rör A från magnetstativet och kassera det. Tillsätt sedan 50 mikroliter magnetiska pärlor till cellsuspensionen i rör B och pipettera upp och ner minst tre gånger.
Placera omedelbart rör B i magnetstativet och inkubera i fem minuter i rumstemperatur. Pipettera försiktigt över den anrikade cellsuspensionen i rör C, så att endast den klara fraktionen samlas upp. Ta bort rör B från magnetstativet och kassera det.
Placera sedan omedelbart rör C i magnetstativet och inkubera i fem minuter i rumstemperatur. Pipettera försiktigt den anrikade cellsuspensionen i ett märkt centrifugrör och fyll på upp till två milliliter med PBS. Överför 50 mikroliter av cellsuspensionen till en provkopp i den automatiserade cellräknaren.
Tillsätt 450 mikroliter PBS för ett utspädningscellstal på 1 till 10.
