För att börja, skaffa en odlingsplatta med Methylomonas art LW13 kolonier. Inokulera kolonierna i sex milliliter nitratmineralsalter i ett glasrör. Försegla röret med en serumpropp och krymptätning av aluminium.
Tillsätt metan med hjälp av en spruta för att skapa en slutlig atmosfär av 50 volymprocent metan i luften. Skaka denna planktoniska flytande kultur med 200 varv per minut i rumstemperatur tills den är grumlig, vilket tar ungefär en dag. Låt de flytande kulturerna passera i förhållandet 1 till 10 i färska medier.
Fortsätt att odla de flytande kulturerna av metanotrofer för att växa i logfasen och nå en optisk densitet vid 600 nanometer på cirka 0,5. För att förbereda sprutan, ta bort de medföljande kolvarna och placera den i en steril behållare. Fäst en steril spets av polytetrafluoreten eller PTFE på varje spruta och placera sprutan i ett vanligt provrörsställ med spetsen nedåt.
Blanda sedan en milliliter av cellerna med fem milliliter nitratmineralsalt och fyra milliliter smält agaros i ett sterilt koniskt rör. Häll långsamt agarosblandningen i sprutan upp till 8 milliliter-markeringen och låt den stelna. Efter cirka 15 minuter försluts sprutan med en steril 20 millimeters butylpropp av gummi.
Fäst propparna med labbtejp och märk sprutan. Fyll sedan en stor spruta på 60 milliliter med 100 % metan och fäst en PTFE-filterspets ansluten till en steril 23-gauge nål. Stick hål i gummiproppen på sprutan med agarosblandningen med en stor spruta och stick in en andra steril nål som gasutlopp.
Tryck ned kolven på den stora sprutan så att 20 milliliter 100 % metan kan spolas genom huvudutrymmet. Ta bort utloppsnålen när det finns en till två milliliter metan kvar i sprutan för att förhindra att syret rinner tillbaka. Inkubera sprutan med agarosblandning och metan vid 18 grader Celsius.
För att extrudera agaros, byt ut PTFE-filtrets spets mot en steril 23-gauge nål och gummiproppen med den medföljande sprutkolven. Tryck långsamt ner kolven för att fördela steg om en milliliter i separata sterila 1.5-milliliters mikrocentrifugrör. Den vilda typen LW13-stammen bildade ett distinkt horisontellt band på ett specifikt djup i gradientsprutan där både metan- och syrekoncentrationerna var låga.
LW13 inokulerat i gradientsprutor visade en motgradient av metan-syre med metanutarmning och syreförbrukning motsvarande djupet på det horisontella bandet. OAT-deletionsmutanten av LW13 saknade den distinkta horisontella bandbildningen som observerats i vildtypsstammen, vilket indikerar genens roll i denna fenotyp.
