Başlamak için, Methylomonas türü LW13 kolonileri içeren bir kültür plakası edinin. Kolonileri bir cam tüp içinde altı mililitre nitrat mineral tuzları ortamında aşılayın. Tüpü bir serum tıpası ve alüminyum kıvrımlı conta ile kapatın.
Havadaki hacimce %50 metan değerinde nihai bir atmosfer oluşturmak için bir şırınga kullanarak metan ekleyin. Bu planktonik sıvı kültürü, yaklaşık bir gün süren bulanıklaşana kadar oda sıcaklığında dakikada 200 devirde çalkalayın. Sıvı kültürleri bir ila 10 oranında taze ortama geçirin.
Faz büyümesini günlüğe kaydetmek için metanotrofların sıvı kültürlerini büyütmeye devam edin ve 600 nanometrede yaklaşık 0,5'lik bir optik yoğunluğa ulaşın. Şırıngayı hazırlamak için, beraberindeki pistonları çıkarın ve steril bir kaba koyun. Her şırıngaya steril bir politetrafloroetilen veya PTFE filtre ucu takın ve şırıngayı, ucu aşağı bakacak şekilde standart bir test tüpü rafına yerleştirin.
Daha sonra, hücrelerin bir mililitresini steril bir konik tüpte beş mililitre nitrat mineral tuzları orta ve dört mililitre erimiş agaroz ile karıştırın. Agaroz karışımını yavaşça sekiz mililitre işaretine kadar şırınganın içine dökün ve katılaşmasına izin verin. Yaklaşık 15 dakika sonra, şırıngayı steril bir 20 milimetre kauçuk bütil tıpa ile kapatın.
Tıpaları laboratuvar bandı ile sabitleyin ve şırıngayı etiketleyin. Ardından, 60 mililitrelik büyük bir şırıngayı %100 metan ile doldurun ve steril 23 gauge iğneye bağlı bir PTFE filtre ucu takın. Şırınganın lastik tıpasını agaroz karışımı ile büyük bir şırınga ile delin ve gaz çıkışı olarak ikinci bir steril iğne yerleştirin.
20 mililitre %100 metanın kafa boşluğundan akmasına izin vermek için büyük şırınganın pistonuna bastırın. Oksijenin geri akışını önlemek için şırıngada bir ila iki mililitre metan kaldığında çıkış iğnesini çıkarın. Şırıngayı agaroz karışımı ve metan ile 18 santigrat derecede inkübe edin.
Agarozu çıkarmak için, PTFE filtre ucunu steril bir 23 gauge iğne ile ve kauçuk tıpayı verilen şırınga pistonu ile değiştirin. Bir mililitrelik artışları ayrı steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dağıtmak için pistonu yavaşça bastırın. Yabani tip LW13 suşu, hem metan hem de oksijen konsantrasyonlarının düşük olduğu gradyan şırıngasında belirli bir derinlikte belirgin bir yatay bant oluşturdu.
Degrade şırıngalarda aşılanan LW13, yatay bandın derinliğine karşılık gelen metan tükenmesi ve oksijen tüketimi ile bir metan-oksijen karşı gradyanı gösterdi. LW13'ün OAT delesyon mutantı, vahşi tip suşta gözlenen belirgin yatay bant oluşumundan yoksundu ve bu da genin bu fenotipteki rolünü gösteriyordu.
