للبدء ، احصل على شرائح الأغاروز المبثوقة من المحاقن المتدرجة ، الملقحة إما بالنوع البري أو أنواع الميثيلومونا الطافرة ، LW13. أضف 0.75 ملليلتر من 0.85٪ كلوريد الصوديوم في الماء إلى عينة الأغاروز المبثوقة ، وقم بالتجانس عن طريق الدوامة. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف العينة من 1 إلى 10 في أنبوب طرد مركزي صغير جديد مع 900 ميكرولتر من محلول الملح.
احتضان العينات بثلاثة ميكرولتر من خليط واحد إلى واحد من بقع SYTO 9 و propidium iodide في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لتحديد الخلايا لكل ملليلتر من الأغاروز ، صوتنة تعليق حبة عد المجهرية في حمام مائي لمدة خمس دقائق. ثم أضف 10 ميكرولتر من التعليق إلى العينة قبل تحليل قياس التدفق الخلوي.
تحليل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي. قارن بين مخططات التشتت الجانبية مقابل مخططات العمليات المتناثرة الأمامية بين عينات التحكم الخالية من الخلايا وعينات الأغاروز الملقحة لرسم بوابات جهد الحدث البكتيري التي تستبعد جزيئات الأغاروز الخلفية. لحساب وحدات تشكيل المستعمرات داخل المحقنة المتدرجة ، أضف 800 ميكرولتر من أملاح النترات المعدنية المتوسطة إلى جزء الأغاروز المبثوق والدوامة لمدة 10 ثوان للمساعدة في سحب العينات.
تحضير صفيحة معقمة من 96 بئرا مع 180 ميكرولتر من أملاح النترات المعدنية المتوسطة في كل بئر. أضف 20 ميكرولترا من عينة الأغاروز المخففة إلى كل بئر في العمود الأول واخلطها. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتخفيف 20 ميكرولترا من العينات بشكل متسلسل عشرة أضعاف ، بدءا من الصف الأول من الآبار.
ملصق لوحة شبكية مربعة تحتوي على مثقاب الأملاح المعدنية بالنترات أو الوسائط المفضلة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، حدد خمسة ميكرولترات من عمود من لوحة 96 بئرا على لوحة البريم. أكد قياس التدفق الخلوي باستخدام عينات الأغاروز المبثوقة أن طفرة حذف الشوفان من LW13 أظهرت انخفاضا في نمو الخلايا مقارنة بسلالة النوع البري.
أدى تكامل المتحور مع جين الشوفان إلى استعادة أعداد الخلايا وتشكيل النطاق إلى مستويات مماثلة للنوع البري ، مما يشير إلى الدور المحدد للجين في تكوين الفرقة.
