Verkrijg om te beginnen de geëxtrudeerde agarosesegmenten uit gradiëntspuiten, geënt met wildtype of mutante methylomona-soort, LW13. Voeg 0,75 milliliter 0,85% natriumchloride in water toe aan het geëxtrudeerde agarosemonster en homogeniseer door vortexen. Verdun het monster verder 1 tot 10 in een nieuwe microcentrifugebuis met 900 microliter zoutoplossing.
Incubeer de monsters met drie microliter van een één-op-één mengsel van SYTO 9 en propidiumjodidevlekken in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Om de cellen per milliliter agarose te bepalen, sonificeert u de suspensie van de microbol tellende parel gedurende vijf minuten in een waterbad. Voeg vervolgens 10 microliter van de suspensie toe aan het monster vóór flowcytometrieanalyse.
Analyseer monsters met behulp van een flowcytometer. Vergelijk zijwaartse verstrooiing versus voorwaarts verstrooide op-plots tussen celvrije controlemonsters en geïnoculeerde agarosemonsters om spanningspoorten voor bacteriële gebeurtenissen te tekenen die achtergrondagarosedeeltjes uitsluiten. Om kolonievormende eenheden in de gradiëntspuit te tellen, voegt u 800 microliter nitraat minerale zouten medium toe aan het geëxtrudeerde agarosesegment en de vortex gedurende 10 seconden om te helpen bij het pipetteren.
Bereid een steriel bord met 96 putjes voor met 180 microliter nitraat, minerale zouten, medium in elk putje. Voeg 20 microliter verdund agarosemonster toe aan elk putje in de eerste kolom en meng. Verdun met een meerkanaalspipet 20 microliter monsters tienvoudig serieel, beginnend bij de eerste rij putjes.
Label: vierkante roosterplaat met nitraat, minerale zouten, vijzel of media naar keuze. Spot met een meerkanaalspipet vijf microliter uit een kolom van de plaat met 96 putjes op de vijzelplaat. Flowcytometrie met behulp van de geëxtrudeerde agarosemonsters bevestigde dat de OAT-deletiemutant van LW13 verminderde celgroei vertoonde in vergelijking met de wildtype stam.
Complementatie van de mutant met het OAT-gen herstelde het aantal cellen en de bandvorming tot niveaus die vergelijkbaar zijn met het wildtype, wat de specifieke rol van het gen bij bandvorming aangeeft.
