Till att börja med, erhåll de extruderade agarossegmenten från gradientsprutor, inokulerade med antingen vildtyp eller muterad metylomona-art, LW13. Tillsätt 0,75 milliliter 0,85 % natriumklorid i vatten till det extruderade agarosprovet och homogenisera genom vortexing. Späd sedan provet 1 till 10 i ett nytt mikrocentrifugrör med 900 mikroliter saltlösning.
Inkubera proverna med tre mikroliter av en 1 till 1 blandning av SYTO 9 och propidiumjodidfläckar i mörker vid rumstemperatur i 15 minuter. För att bestämma cellerna per milliliter agaros, sonikera mikrosfären som räknar pärlsuspension i ett vattenbad i fem minuter. Tillsätt sedan 10 mikroliter av suspensionen till provet före flödescytometrianalys.
Analysera prover med hjälp av en flödescytometer. Jämför sidospridnings- kontra framåtspridda op-diagram mellan cellfria kontrollprover och inokulerade agarosprover för att rita bakteriella händelsespänningsgrindar som utesluter agarospartiklar i bakgrunden. För att räkna kolonibildande enheter i gradientsprutan, tillsätt 800 mikroliter nitratmineralsalter till det extruderade agarossegmentet och virvla i 10 sekunder för att underlätta pipettering.
Förbered en steril platta med 96 brunnar med 180 mikroliter nitratmineralsalter i varje brunn. Tillsätt 20 mikroliter utspädd agarosprov till varje brunn i den första kolonnen och blanda. Använd en flerkanalspipett för att seriespäda 20 mikroliter prover tiofaldigt, med början från den första raden av brunnar.
Märk den fyrkantiga gallerplattan som innehåller nitrat, mineralsalter, skruv eller valfritt medium. Använd en flerkanalspipett för att placera fem mikroliter från en pelare på 96-hålsplattan på skruvplattan. Flödescytometri med hjälp av extruderade agarosprover bekräftade att OAT-deletionsmutanten av LW13 visade minskad celltillväxt jämfört med vildtypsstammen.
Komplementering av mutanten med OAT-genen återställde cellantal och bandbildning till nivåer liknande den vilda typen, vilket indikerar genens specifika roll i bandbildningen.
