Fortsæt med at udføre reaktionen efter funktionalisering af begge ender af det lineære DNA-substrat. Tag først fire S-400 spin-kolonner og hvirvl dem i mindst 30 sekunder for at gensuspendere harpiksen. Centrifuger dem derefter i et minut ved 735G for at fjerne opbevaringsbufferen.
Overfør søjlerne til rene 1,5 ml rør. Tilsæt straks 100 mikroliter af den dobbelt funktionaliserede lineære DNA-opløsning til hver kolonne. Centrifuger kolonnerne i to minutter ved 735G for at strømme DNA'et gennem søjlen, mens de ikke-inkorporerede nukleotider bevares.
Efter at have samlet gennemstrømningen indeholdende DNA'et fra de fire kolonner, måles volumenet med en pipette. Dernæst hvirvel M-280 streptavidin-belagte magnetiske perler i 30 sekunder for at gensuspendere dem. Overfør fire milligram af de ophængte magnetiske perler til et rent 1,5 milliliters rør.
Placer røret i et magnetisk stativ i et minut for at samle perlerne, før du fjerner opbevaringsbufferen. Resuspender perlerne i en milliliter buffer A ved at hvirvle i fem sekunder, før perlerne inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Saml perlerne ved at placere røret i en magnetisk holder i et minut.
Efter fjernelse af buffer A ophænges perlerne i 400 mikroliter 2X buffer A ved pipettering. Tilsæt derefter 400 mikroliter af den funktionaliserede DNA-opløsning til perlerne, og bland forsigtigt ved pipettering. Inkuber perle-DNA-blandingen natten over ved fire grader Celsius med rotation fra ende til ende.
Den næste dag skal du bruge det magnetiske stativ til at fjerne supernatanten, før du beregner den samlede mængde DNA bundet til de magnetiske perler. Vask derefter perlerne sekventielt med buffer B og buffer C. Ophæng perlerne igen i 300 mikroliter buffer C og lav fire 75 mikroliters alikvoter.
