Ga verder met het uitvoeren van de reactie na het functionaliseren van beide uiteinden van het lineaire DNA-substraat. Neem eerst vier S-400 spinkolommen en draai ze gedurende ten minste 30 seconden om de hars opnieuw te suspenderen. Centrifugeer ze vervolgens een minuut op 735G om de opslagbuffer te verwijderen.
Breng de kolommen over om buizen van 1,5 milliliter schoon te maken. Voeg onmiddellijk 100 microliter van de dubbel gefunctionaliseerde lineaire DNA-oplossing toe aan elke kolom. Centrifugeer de kolommen gedurende twee minuten bij 735G om het DNA door de kolom te laten stromen met behoud van de niet-opgenomen nucleotiden.
Nadat u de doorstroom met het DNA van de vier kolommen hebt samengevoegd, meet u het volume met een pipet. Vervolgens wervelt de M-280 met streptavidine gecoate magnetische kralen gedurende 30 seconden om ze opnieuw te suspenderen. Breng vier milligram van de geresuspendeerde magnetische kralen over in een schone buis van 1,5 milliliter.
Plaats de tube een minuut in een magnetisch rek om de kralen te verzamelen voordat u de opslagbuffer verwijdert. Resuspendeer de kralen in een milliliter buffer A door vijf seconden te vortexen voordat u de kralen vijf minuten bij kamertemperatuur incubeert. Verzamel de kralen door de tube een minuut in een magnetische houder te plaatsen.
Na het verwijderen van buffer A, resuspendeert u de korrels in 400 microliter 2X buffer A door te pipetteren. Voeg vervolgens 400 microliter van de gefunctionaliseerde DNA-oplossing toe aan de kralen en meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer het DNA-mengsel van de kraal een nacht bij vier graden Celsius met rotatie van het einde over het einde.
Gebruik de volgende dag het magnetische rek om het supernatans te verwijderen voordat u de totale hoeveelheid DNA berekent die aan de magnetische kralen is gebonden. Was de korrels vervolgens achtereenvolgens met buffer B en buffer C.Resuspendeer de korrels in 300 microliter buffer C en maak vier aliquots van 75 microliter.
