二重官能基化直鎖状DNA基質のストレプトアビジン被覆磁気ビーズへの結合

直鎖状DNA基質の両端を官能基化した後、反応を行う。まず、S-400スピンカラムを4本取り、それらを少なくとも30秒間ボルテックスして樹脂を再懸濁します。その後、735Gで1分間遠心分離し、保存バッファを取り出します。

カラムを1.5ミリリットルのチューブに取り替えます。直ちに、100 マイクロリットルの二重官能基化直鎖状 DNA 溶液を各カラムに加えます。カラムを 735G で 2 分間遠心分離し、取り込まれていないヌクレオチドを保持したまま DNA をカラムに流します。

4つのカラムからDNAを含むフロースルーをプールした後、ピペットで容量を測定します。次に、M-280ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを30秒間ボルテックスして再懸濁します。再懸濁した磁気ビーズの4ミリグラムをきれいな1.5ミリリットルのチューブに移します。

チューブを磁気ラックに1分間置き、ビーズを収集してから、ストレージバッファーを取り外してください。ビーズを1ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、5秒間ボルテックスしてから、ビーズを室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気ホルダーに1分間置いて、ビーズを収集します。

バッファーAを除去した後、ピペッティングによりビーズを400マイクロリットルの2XバッファーAに再懸濁します。その後、400マイクロリットルの官能基化DNA溶液をビーズに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。ビーズDNA混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、端から端まで回転させます。

翌日、磁気ビーズに結合したDNAの総量を計算する前に、磁気ラックを使用して上清を取り除きます。次いで、緩衝液Bおよび緩衝Cでビーズを順次洗浄し、ビーズを300マイクロリットルの緩衝Cに再懸濁し、4つの75マイクロリットルのアリコートを作製する。