Prossiga para realizar a reação após funcionalizar ambas as extremidades do substrato de DNA linear. Primeiro, pegue quatro colunas de rotação S-400 e as vortex por pelo menos 30 segundos para ressuspender a resina. Em seguida, centrifugue-os por um minuto a 735G para remover o buffer de armazenamento.
Transfira as colunas para tubos limpos de 1,5 mililitro. Imediatamente, adicione 100 microlitros da solução de DNA linear duplamente funcionalizada a cada coluna. Centrifugue as colunas por dois minutos a 735G para fluir o DNA através da coluna, retendo os nucleotídeos não incorporados.
Depois de agrupar o fluxo contendo o DNA das quatro colunas, meça o volume com uma pipeta. Em seguida, o vórtice M-280 revestiu com estreptavidina esferas magnéticas por 30 segundos para ressuspendê-las. Transfira quatro miligramas das esferas magnéticas ressuspensas para um tubo limpo de 1,5 mililitro.
Coloque o tubo em um rack magnético por um minuto para coletar as contas antes de remover o buffer de armazenamento. Ressuspenda as esferas em um mililitro de tampão A por vórtice por cinco segundos antes de incubar as esferas em temperatura ambiente por cinco minutos. Colete as contas colocando o tubo em um suporte magnético por um minuto.
Depois de remover o tampão A, ressuspenda os grânulos em 400 microlitros de tampão 2X A pipetando. Em seguida, adicione 400 microlitros da solução de DNA funcionalizada às esferas e misture delicadamente pipetando. Incube a mistura de DNA do grânulo durante a noite a quatro graus Celsius com rotação de ponta a ponta.
No dia seguinte, use o rack magnético para remover o sobrenadante antes de calcular a quantidade total de DNA ligado às esferas magnéticas. Em seguida, lave as contas sequencialmente com tampão B e tampão C. Ressuspenda as contas em 300 microlitros de tampão C e faça quatro alíquotas de 75 microlitros.
