Приступайте к выполнению реакции после функционализации обоих концов субстрата линейной ДНК. Сначала возьмите четыре вращающиеся колонны S-400 и закрутите их в течение не менее 30 секунд, чтобы повторно суспендировать смолу. Затем центрифугируйте их в течение одной минуты при температуре 735G, чтобы удалить буфер для хранения.
Переложите колонки в чистые 1,5 миллилитровые трубки. Сразу же добавьте по 100 микролитров дважды функционализированного раствора линейной ДНК в каждую колонку. Центрифугируйте колонки в течение двух минут при температуре 735G, чтобы ДНК прошла через колонку, сохраняя при этом неинкорпорированные нуклеотиды.
После объединения проточного потока, содержащего ДНК из четырех столбцов, измерьте объем с помощью пипетки. Далее вихревыми М-280 покрытые стрептавидином магнитные шарики на 30 секунд для их ресуспендирования. Переложите четыре миллиграмма ресуспендированных магнитных шариков в чистую 1,5-миллилитровую трубку.
Поместите трубку в магнитный штатив на одну минуту, чтобы собрать шарики, прежде чем снимать буфер для хранения. Повторно суспендируйте шарики в одном миллилитре буфера А, вортексируя в течение пяти секунд, прежде чем инкубировать шарики при комнатной температуре в течение пяти минут. Соберите бусины, поместив трубку в магнитный держатель на одну минуту.
После удаления буфера А повторно суспендируйте шарики в 400 микролитрах 2Х буфера А с помощью пипетирования. Затем добавьте 400 микролитров функционализированного раствора ДНК в гранулы и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Инкубируйте смесь ДНК гранул в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с вращением из конца в конец.
На следующий день с помощью магнитной стойки удалите надосадочную жидкость, прежде чем рассчитать общее количество ДНК, связанной с магнитными шариками. Затем последовательно промойте бусины буфером В и буфером С. Суспендируйте бусины в 300 микролитрах буфера С и сделайте четыре аликвоты по 75 микролитров.
